影响抗原-抗体特异性结合的因素包括：
1、酸碱度：抗原抗体特异性结合的*适酸碱度pH 6.0-8.0；
2、电解质：电解质可以影响溶液pH，也可影响蛋白质的等电点；（因此，WB的洗膜缓冲液，均用PBS/PBST或TBS/TBST等平衡盐液体，抗体稀释液和封闭液也多是上述液体配置，是为了保证抗原抗体反应的*条件）。
3、温度：一般为15-40℃，*适为37℃；（常用的一抗孵育时间为：室温，2-3h；二抗孵育时间：室温，1h。此外，4℃*封闭也应用广泛，这与抗原抗体反应的反应特点有关，涉及抗原抗体的结合率）。
