RT-PCR常见问题
圣宾仪器科技上海有限公司
RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：
1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
Q1:
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？
A1：必须
在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？
Q2：RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？
A2：一定要做内参的，每一次，不作内参的结果是不可信的，电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，
RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），*分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。
1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是*表达量，除非你能准确知道来自细胞，但是细胞还有死的呢。
2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为*终结果的，
3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和taq。
Q3：
1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm值吗？
2 PCR时20微升体系中cDNA应加比较合适？MgCl2应加？各个成分的量有无确定标准？
A3：
1 一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.
2 只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,实际上没有要求那么，我们实验室都是固定量不变的。
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