产品仅用于科研参数规格：
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产品名称 |
禽流感病毒H5N1亚型荧光PCR法检测试剂盒 |
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规格 |
50T |
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货号 |
FS-P63245 |
PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
特点：
◇高特异性：与其他病毒无交叉反应，无非特异性扩增；
◇高灵敏度：检测灵敏度可达10~100拷贝；
◇操作简便：该系列所有试剂均采用相同的体系和条件，可同时进行多个检测；
◇高通量：多种双重PCR检测以及三重PCR检测试剂盒。
定量PCR方法：
a、竞争法
选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
b、内参照法
在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗di高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，*终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer
5μl
dNTP mixl
4μl
引物1（10pM）
2μl
引物2（10PM） 2μl
Taq酶（2U/μl） 1μl
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，总线后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。总线好设立一个的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用总线高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
小鼠胰腺癌细胞(B类);Pan02 透明质酸酶(含100mL酶解缓冲液) 10mL4-溴芘(>95.0%(GC))质量规格：>95.0%(GC)4-Bromopyrene
A549/DDP, 人肺腺癌耐药细胞株 Human1,6-二氨基芘(>98.0%(HPLC)(N))质量规格：>98.0%(HPLC)(N)1,6-Diaminopyrene
PLA2G1B Others Human 人 PLA2G1B / PLA2 人细胞裂解液 (阳性对照) 1,3-二氨基芘质量规格：1,3-Diaminopyrene
人小胶质细胞RNAHM miRNA5 μg2,7-二叔丁基芘(>98.0%(GC))质量规格：>98.0%(GC)2,7-Di-tert-butylpyrene
CFD Others Human 人 CFD / Adipsin 人细胞裂解液 (阳性对照) 1-溴甲基萘质量规格：>99%1-(Bromomethyl)naphthalene
N-羟基丁二(>98%,BR) N-Hydroxysuccinimide 质量规格：>98%,BR 动物细胞/组织活性线粒体分离试剂盒10/50
没食子酸一水物(标准品) Gallic acid monohydrate 质量规格：HPLC>98%,标准品 动物细胞/组织亮氨酸氨基肽酶(leucineaminopeptidase;LAP)电泳分析试剂盒5
没食子酸一水物 Gallic acid monohydrate 质量规格：>98%,AR 动物细胞/组织莽草酸脱氢酶(shikimatedehydrogenase;SkDH)电泳分析试剂盒5
1-酮戊二酸二钠盐(>98%,BR) a-Ketoglutaric acid, di salt, dihydrate 质量规格：>98%,BR 动物细胞/组织葡萄糖0酸变位酶(phosphoglucomase;PGM)电泳分析试剂盒5
氢氧化钙(>95%,BR) Calcium hydroxide 质量规格：>95%,BR 动物细胞/组织葡萄糖6-0酸异构酶(glucose-6-phosphateisomerase;GPI)电泳分析试剂盒5
低粘度羟丙基纤维素 HPC, hydroxypropyl cellulose 质量规格：150~400 mpa.s,BR 动物细胞/组织细胞色素C释放比色量检测试剂盒10
L(+)二钠二水(>98%,BC ) L(+) tartrate dihydrate 质量规格：>98%,BC 动物细胞/组织细胞色素C释放凋亡检测试剂盒(含抗体)10
盐酸吡哆胺(>98%,BC ) Pyridoxamine, di 质量规格：>98%,BC 动物细胞/组织细胞色素C释放凋亡检测试剂盒10
水杨酸钠(>99%,USP) salicylate 质量规格：>99%,USP 动物细胞/组织细胞色素C释放凋亡检测试剂盒10
3-(环己氨基 )-1-丙磺酸钠(分子生物学级) CAPS,
salt 质量规格：>99%,分子生物学级 动物细胞/组织线粒体氧化物歧化酶(Mn/FeSOD)分离试剂盒50
动物细胞/组织高质化线粒体分离试剂盒10 苹果酸脱氢酶(>12,000U/ml，BC) Malate dehydrogenase 质量规格：>12,000U/ml，BC
动物细胞/组织活性线粒体分离试剂盒10/50 N-羟基丁二(>98%,BR) N-Hydroxysuccinimide 质量规格：>98%,BR
动物细胞/组织亮氨酸氨基肽酶(leucineaminopeptidase;LAP)电泳分析试剂盒5 没食子酸一水物(标准品) Gallic acid monohydrate 质量规格：HPLC>98%,标准品
动物细胞/组织莽草酸脱氢酶(shikimatedehydrogenase;SkDH)电泳分析试剂盒5 没食子酸一水物 Gallic acid monohydrate 质量规格：>98%,AR
动物细胞/组织葡萄糖0酸变位酶(phosphoglucomase;PGM)电泳分析试剂盒5 1-酮戊二酸二钠盐(>98%,BR) a-Ketoglutaric acid, di salt, dihydrate 质量规格：>98%,BR
动物细胞/组织葡萄糖6-0酸异构酶(glucose-6-phosphateisomerase;GPI)电泳分析试剂盒5 氢氧化钙(>95%,BR) Calcium hydroxide 质量规格：>95%,BR
动物细胞/组织细胞色素C释放比色量检测试剂盒10 低粘度羟丙基纤维素 HPC, hydroxypropyl cellulose 质量规格：150~400 mpa.s,BR
动物细胞/组织细胞色素C释放凋亡检测试剂盒(含抗体)10 L(+)二钠二水(>98%,BC ) L(+) tartrate dihydrate 质量规格：>98%,BC
动物细胞/组织细胞色素C释放凋亡检测试剂盒10 盐酸吡哆胺(>98%,BC ) Pyridoxamine, di 质量规格：>98%,BC
动物细胞/组织细胞色素C释放凋亡检测试剂盒10 水杨酸钠(>99%,USP) salicylate 质量规格：>99%,USP
禽流感病毒H5N1亚型荧光PCR法检测试剂盒注意事项：
①加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
②使用干净的塑料容器配置洗涤液。
③按照鸡血红蛋白(HB)ELISA检测试剂盒说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
④底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
⑤洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
⑥使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器 。
⑦实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
⑧试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
⑨不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
