PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix 2mM
4 μl 引物110pM
2 μl 引物210pM
2 μl Taq酶 2U/μl
1 μl DNA模板50ng-1μg/μl
1 μl 加ddH2O至 50 μl
特点：产品仅用于科研
◇高特异性：与其他病毒无交叉反应，无非特异性扩增；
◇高灵敏度：检测灵敏度可达10~100拷贝；
◇操作简便：该系列所有试剂均采用相同的体系和条件，可同时进行多个检测；
◇高通量：多种双重PCR检测以及三重PCR检测试剂盒。
参数规格：
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产品名称 |
鼠疫杆菌荧光PCR法检测试剂盒 |
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规格 |
50T |
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货号 |
FS-P63641 |
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer
5μl
dNTP mixl
4μl
引物110pM
2μl
引物210PM 2μl
Taq酶2U/μl 1μl
1 μl DNA模板50ng-1μg/μl
加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，总线后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。总线好设立一个的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用总线高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
注意事项：
①加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
②使用干净的塑料容器配置洗涤液。
③按照鸡血红蛋白(HB)ELISA检测试剂盒说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
④底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
⑤洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
⑥使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器 。
⑦实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
⑧试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
⑨不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
脑膜细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)AdoMetS-腺甘基蛋酸100克BR，80%
CSNK2A1 Others Human 人 CSNK2A1 / CK2A1 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) 连本三加醋水合物 1,2,3-Bqnzqnqtriccrboxylic ccid 269-21-7
小鼠单核巨噬细胞白血病细胞;RAW 264.7 [RAW264.7;异炳基间本; 3-异炳基本; 1-异炳基-3-基本; 1-基-3-异炳基本; 间本异炳烷; 间异炳基本烷; 间聚伞花速; M-CyMqnq;Isopropyl-M-toluqnq; 1-Mqthyl-3-isopropylbqnzqnq; 3-Isopropyltoluqnq; 1-Isopropyl-3-Mqthylbqnzqnq; Mqthyl-(3-Mqthylqthyl)bqnzqnq; M-CyMol; 232-77-3
CHO/dhFr-细胞，仓鼠二氢叶酸还原酶缺陷细胞 人肝癌细胞,HuH-7细胞 CL-0144LoVo(人大肠癌细胞)5×106cells/瓶×22-Thiouracil2-硫尿嘧啶5克3.5N，0.25×50㎜
仓鼠肺细胞;V792438-80-4L(-)-岩藻糖L-FUCOSE
氟化镍四水(>98%,BR) Nickel (II) fluoride tetrahydrate 质量规格：>98%,BR 非同位素HRP化学发光法DNA南方杂交试剂盒5
二氧化硅(>99.9%,BR) Silicon (IV) oxide 质量规格：>99.9%,BR 非同位素HRP化学发光法RNA北方杂交试剂盒5
氟化锶(>97%,BR) Strontium fluoride 质量规格：>97%,BR 非突触体脑组织线粒体分离试剂盒10
丁香醛(>98%,BP) Syringaldehyde 质量规格：>98%,BP 非吸烟者人体肺组织S9组分(5毫克/毫升)500微升
四氮唑紫(>98%,BS) Tetrazolium violet 质量规格：>98%,BS 非吸烟者人体肺组织微粒体组分(5毫克/毫升)500微升
2-甲基吲哚(>97%，BR) 2-Methylindole 质量规格：>97%，BR 分离高尔基体度双酶法(GT/NCR)检测试剂盒20
硫酸铵铝十二水(>98%,BR) Aluminum ammonium sulfate, dodecahydrate 质量规格：>98%,BR 分离溶酶体度双酶法(COX/AP)检测试剂盒20
AMP缓冲液(>98%,BR) AMP buffer concentrate 质量规格：>98%,BR 分离线粒体度双酶法(SDH/AP)检测试剂盒20
苯并咪唑(>98%,BR) Benzimidazole 质量规格：>98%,BR 分子生物级化乙锭(EthidiumBromide)染色液(1毫克/毫升)或(10毫克/毫升)100毫升
羧肽酶 B >170 U/mg
Carboxypeptidase B 质量规格：BC 酚藏花红(PHENOSAFRANINE)植物细胞繁殖测定试剂盒100
非同位素HRP化学发光法DNA斑点杂交试剂盒5 N,N'-二琥珀基碳酸酯(>98%,EP) N,N'-Disuccinimidyl carbonate (DSC) 质量规格：>98%,EP
非同位素HRP化学发光法DNA南方杂交试剂盒5 氟化镍四水(>98%,BR) Nickel (II) fluoride tetrahydrate 质量规格：>98%,BR
非同位素HRP化学发光法RNA北方杂交试剂盒5 二氧化硅(>99.9%,BR) Silicon (IV) oxide 质量规格：>99.9%,BR
非突触体脑组织线粒体分离试剂盒10 氟化锶(>97%,BR) Strontium fluoride 质量规格：>97%,BR
非吸烟者人体肺组织S9组分(5毫克/毫升)500微升 丁香醛(>98%,BP) Syringaldehyde 质量规格：>98%,BP
非吸烟者人体肺组织微粒体组分(5毫克/毫升)500微升 四氮唑紫(>98%,BS) Tetrazolium violet 质量规格：>98%,BS
分离高尔基体度双酶法(GT/NCR)检测试剂盒20 2-甲基吲哚(>97%，BR) 2-Methylindole 质量规格：>97%，BR
分离溶酶体度双酶法(COX/AP)检测试剂盒20 硫酸铵铝十二水(>98%,BR) Aluminum ammonium sulfate, dodecahydrate 质量规格：>98%,BR
分离线粒体度双酶法(SDH/AP)检测试剂盒20 AMP缓冲液(>98%,BR) AMP buffer concentrate 质量规格：>98%,BR
分子生物级化乙锭(EthidiumBromide)染色液(1毫克/毫升)或(10毫克/毫升)100毫升 苯并咪唑(>98%,BR) Benzimidazole 质量规格：>98%,BR
鼠疫杆菌荧光PCR法检测试剂盒定量PCR方法：
a、竞争法
选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增其中一个引物为荧光标记。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
b、内参照法
在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗di高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，*终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
