肠道病毒EV71/柯萨奇病毒CA16PCR检测试剂盒双重荧光-PCR法

原理是由一对引物介导，能在动植物体外对特定基因(DNA)片断进行快速酶促扩增，经过n个热循环扩增，扩增产物中所含特定基因数是原始模板数的(1+E)n(0＜E＜1,扩增效率＝倍，使得检测扩增产物中的特定基因成为可能。
特异性强
  PCR反应的特异性决定因素为：
  ①引物与模板DNA特异正确的结合；
  ②碱基配对原则；
  ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。

产品名称：肠道病毒EV71/柯萨奇病毒CA16PCR检测试剂盒双重荧光-PCR法
产品分类：双重荧光-PCR法
规格：50T

组成及试剂配制:
1、酶标板：一块（96孔）
2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/L，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3、 样品稀释液：1×20ml。
4、 检测稀释液A：1×10ml。
5、 检测稀释液B：1×10ml。

实验注意事项：
1）RT-PCR可以检测组织、细胞、血液、细菌等很多材料，不同的样本有不同要求，实验前请充分沟通确认实验方案和样本情况；
2）客户尽可能提供实验的背景信息、物种、基因准确的名称和ID号；
3）客户尽量不要提供DNA或RNA样品。
4）样本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。
实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，*通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两类，探针类是利用与靶细胞序列特异性杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类是利用荧光染料或者特异性设计的引物来指示扩增的增加。运用该技术可以对DNA、RNA样品进行定量（包括*定量和相对定量）和定性分析。
主要服务：DNA或RNA的*定量分析、基因表达差异分析、基因分型。
主要技术：引物设计、RNA提取、cDNA合成、qPCR。

使用方法:
一、样品 DNA 的制备
用自选方法提取 Cps DNA。注意：DNA 纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品 DNA，后面的 PCR 再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备 Cps 标准曲线（以 10-10E6 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的 DN**段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2 和 1 号。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 纯水（*用带芯枪头，下同）。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用 TE 缓冲液或纯水 10 倍梯度稀释到10E7 拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至 10E7拷贝/μL，建议每次稀释 10 倍，梯度稀释至 10E7 拷贝/μL）。
4. 在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的 Cps 阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。
5. 换枪头，从 6 号管中取 5 μL 溶液到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 10E5拷贝/μL 的阳性对照。
6. 换枪头，从 5 号管中取 5 μL 溶液到 4 号管中，重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。
7. NC 管中不加任何阳性对照。
8. 从 1-6 号管中分别取 5 μL 和待测样品一起进行定量 PCR（见下步），每个样品做 3 次重复。PCR 后得到每个阳性对照稀释样品的荧光 PCR Ct 值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。

Buffer peptone water（BPW）
0.85%无菌生理盐水（9ml/支） 9ml*20支/包 用于样品稀释处理
0.85% Sterile Saline
0.85%无菌生理盐水（10ml/支） 10ml/支*20 用于样品稀释处理
0.85% Sterile Saline
月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤LST管（双料，含小导管） 10ml/支*20 用于大肠杆菌、大肠菌群的测定
Lauryl Sulfate Tryptose Broth
10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤 9ml*20支/包 用于金黄色葡萄球菌的MPN测定及增菌培养
10% NaCl Trypticase Soy Broth
10%氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤 10ml*20支/包 用于金黄色葡萄球菌的MPN测定及增菌培养
10% NaCl Trypticase Soy Broth
李氏菌增菌肉汤（LB2） 9ml*20支/包 用于李氏菌二步增菌
Listeria Enrichment Broth Base
李氏菌增菌肉汤（LB1） 9ml*20支/包 用于李氏菌二步增菌
Listeria Enrichment Broth Base
胰酪胨大豆多粘菌素肉汤 10ml/支*20 用于蜡样芽孢杆菌的MPN值测定
Trypticase-Soy-Polymyxin Broth Base
LST发酵管（含小导管） 10ml*20支/包 每管10ml
大肠杆菌O157检验培养基
三糖铁（TSI）琼脂 250g 生化培养基，用于肠杆菌科细菌的生化反应筛选（GB标准）
TSI Agar
山梨醇麦康凯琼脂添加剂 1ml*5 每200mlHB0121培养基中添加1支（含头孢克肟0.01mg和亚碲酸钾0.5mg）
Sorbitol MacConkey Agar Additives
月桂基硫酸盐胰蛋白胨MUG培养基 250g 用于O157菌检测，不含MUG（SN标准）
LST-MUG
4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷(MUG) 0.1g 0.01g添加于100mlHB0146（LST-MUG）中，用于O157鉴定
MUG
mEC肉汤 250g 用于0157选择性增菌(USDA-FSIS方法)
mE.Coli Broth
mTSB肉汤 250g 用于0157选择性增菌(ISO方法)
mTSB Broth With Novobiocin
SD-39琼脂 250g 用于滤膜法大肠杆菌0157的分离培养(NEOGEN方法)
SD-39 Agar
改良山梨醇麦康凯(CT-SMAC)琼脂 250g 用于大肠杆菌O157的分离培养（GB）标准
Modified Sorbitol Maconkey Agar
肠道病毒EV71/柯萨奇病毒CA16PCR检测试剂盒双重荧光-PCR法改良山梨醇麦康凯琼脂添加剂 1ml*5支 每支添加于200ml HB0121-3中
Modified Sorbitol MacConkey Agar Additives
改良EC肉汤(mEC+n) 250g 用于0157选择性增菌(GB标准)
Modified EC Broth
山梨醇麦康凯琼脂基础（SMAC） 250g 用于大肠杆菌O157的分离培养
Sorbitol Maconkey Agar Base