SAS细胞

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产品名称:舌鳞癌细胞
规格:舌鳞癌；女性
形态特性:DMEM
生长特性:贴壁
特征特性:
培养条件:

实验要点及说明：

1．本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法； 

2．所使用的盖玻片应该为玻璃制造，并经过铬酸洗液处理； 

3．盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻； 

4．如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率； 

5．如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。

实验事项：

1. 试剂准备：所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。  实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。

2.   加样：加样或加试剂时，请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，前一个孔与后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育"时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间(包括标准品及所有样品)好控制在10分钟内，如标本数量多，使用多道移液器加样。

3.   孵育：为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。

4.   洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响后的酶标仪读数。

5.  试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请确配置标准品及工作液，尽量不要微量配置(如吸取检测溶液A时，一次不要小于10μl)，以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。

6.  反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如，每隔10分钟)，如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

7.  底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。

    建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

    如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请后乘以稀释倍数。

培养步骤：

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察Ⅱ型肺泡上皮细胞|细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

Urease Agar Base
40%尿素水 5ml*10 加入尿素酶琼脂基础
40%Urea Water
V-P半固体琼脂 250g 生化培养基，用于细菌V-P试验（SN标准）
Voges-Proskauer Semisolid Agar
硝酸盐*培养基基础 10 生化培养基，用于细菌硝酸盐还原试验，KCN抑制试验（GB、SN标准）
Nitrate(KCN) Broth Base
丙二酸钠培养基 10 生化培养基，用于细菌丙二酸盐利用试验（GB、SN标准）
Malonate Broth
卫矛醇半固体琼脂 10 生化培养基，用于细菌卫予醇发酵试验（SN标准）
Dulcitol Semisolid Agar
GN增菌液 250g 主要用于志贺氏菌的增菌培养，亦可用于沙门氏菌增菌培养（GB标准）
Gram Negative Enrichment Broth
WS琼脂 250g 用于沙门氏菌的选择性分离（GB标准）
WS Salmonella Agar
葡萄糖铵培养基 250g 用于志贺氏菌的葡萄糖铵试验（GB标准）
Ammonium Dextrose Medium
葡萄糖半固体培养基 250g 用于志贺氏菌的复合生化试验（GB标准）
Dextrose Semisolid Medium
动力－吲哚－尿素培养基基础(MIU) 250g 用于细菌的复合生化试验
Motility Indol Urea Medium Base
亚硒酸盐增菌液(SF) 250g 用于增殖标本中的沙门氏菌
Selenite Enrichment Medium
醋酸铅培养基 250g 用于硫化氢试验
Lead Acetate Medium
SIM培养基 250g 用于硫化氢、动力、吲哚试验
Hydrogen Sulfide Indole Motility Medium
乳糖肉汤 250g 用于食品中沙门氏菌检验前增菌
Lactose Broth
煌绿琼脂 250g 用于沙门氏菌的分离培养
Brilliant Green Agar
SAS细胞去氧胆酸盐枸橼酸盐琼脂 250g 用于沙门氏菌的分离培养
Desoxycholate Citrate Agar
吲哚培养基（蛋白胨水） 10g 生化培养基，用于细菌靛基质试验，亦称色氨酸肉汤（SN标准）
Indole Medium
EF-18琼脂 250g 用于滤膜法检测食品中沙门氏菌（SN/T1059.1）
EF-18 Agar
RVS肉汤 250g 用于食品中沙门氏菌检验选择性增菌(ISO标准)
RVS Broth
MKTTn肉汤（ISO） 250g 用于食品中沙门氏菌检验选择性增菌(ISO标准)

操作流程：

1.1主要试剂与仪器：倒置相差显微镜（日本 olympus imt-413），co2孵箱（日本yamato it-61）。

1.2 hek-293细胞的复苏培养传代及冻存：

1.2.1 细胞的复苏培养 从液氮罐中取出冻存管,立即投入37℃水浴,并不断的摇动,使之迅速融化。 将溶解的细胞冻存管取出,用酒精消毒后打开,吸出溶有细胞的冻存液,加入事先装好培养液（37℃预热，8～10倍体积）离心管内,稍微吹打混匀,然后1000rpm 5min,去除上清,加入适量培养液,吹打成细胞悬液, 以1×105/ml密度接种于25cm2培养瓶内，在37℃、5％co2及饱和湿度下培养。

1.2.2 细胞传代 原代培养的hek－293细胞48h换液1次，细胞长至60%～70%融合时，用0.25%胰酶消化1～2min，将培养瓶再用手掌轻轻敲打使细胞脱壁、悬浮、分散，为使细胞进一步分散可用吹打管轻轻吹打几次，获得细胞悬液，然后加入倍量的培养基，温和混匀，吸管分装混合液，传代扩增细胞。

1.3 细胞形态的观察 在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况及形态特征。

1.4 细胞的计数 常规消化细胞，待细胞变圆、脱壁并浮起，加入少量培养基离心，再用pbs重悬并吹打制成细胞悬液。在细胞计数板盖玻片的一侧加微量细胞悬液，用10×物镜观察计数板四角大方格细胞数，按公式计算出细胞数。细胞数/ml原液＝(四方格细胞数之和/4) ×104。

1.5 细胞的贴壁率 指数生长期的细胞，以0.25％胰酶消化成单细胞悬液，计数后分别接种于12个25cm2培养瓶中，每两小时随机取出3瓶细胞，吸除培养基及未贴壁细胞，加入胰消化酶消化、计数已贴壁细胞，取其平均值，按照公式：贴壁率(%)=(已贴壁细胞数/接种细胞数) ×100％，计算贴壁率。

1.6 生长曲线 取指数生长期的细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，以1×104/孔接种于24孔板，每孔加入1ml培养基。每天随机取3孔，计数每孔细胞的数目并计算平均值。连续计数10d，绘制细胞生长曲线。