土霉素四环素金霉素多残留分析的HPLC方法

1．液相色谱法(HPLC):namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

(1)试剂和溶液

①土霉素标准品

②四环素标准品

③金霉素标准品

④乙腈(色谱纯)

⑤甲醇(色谱纯)

⑥三氯甲烷(分析纯)

⑦正己烷(分析纯)

⑧草酸(分析纯)

⑨无水磷酸氢二钠(分析纯)

⑩柠檬酸(分析纯)

⑾EDTA-Naz(分析纯)

⑿去离子水

⒀MckVaine缓冲液配制：pH 4．O

准确称取无水磷酸氢二钠28．:namespace prefix = st1 ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags" />41g(12结晶水的则称71．6gJ用水溶解并定容于1000ml容量瓶中，简称溶液A；准确称取柠檬酸2L 00g溶于水中并定容于1000ml容量瓶中，简称溶液B。取625ml溶液A和1000mi溶液B混匀，调节pH值至4．0+0．05。

⒁MCI-Vaine-Na~EDTA提取液：准确称取60、49g的EDTA—Na2，溶解于1625m1的MCI-Vaine缓冲液中，使成含O．0lmol／LEDTA-Naz的MCI-Vaine液。此溶液为提取液。

⒂0．01mol／L草酸溶液：称取草酸L 26g，用水溶解定容于1000ml容量瓶中。

⒃0．01mol几草酸甲醇溶液：称取草酸L 26g，用甲醇溶解并稀释至1000ml。

⒄标准贮备液：称取土霉素、四环素、金霉素标准晶各o．1080g，用甲醇溶解并定容于lOOml棕色容量瓶中。为lmg／ml贮备液，一20~C保存，3个月有效。

⒅标准中间工作液：10(~g／mI，取ling／m1贮备液2．5ml，用甲醇稀释并定容于25ml棕色容量瓶中。10t~g／m1，取10Cug／m1标准贮备液2．5ml，用甲醇稀释并定容于25ml棕色容量瓶中。

⒆标准工作液：移取适量100~g／ml或10ug／ml标准中间工作液于10ml棕色容量瓶中，加6．0ml甲醇草酸液，并用水稀释至刻度，摇匀。配制成浓度为0．05ug／m1、0．1ug／m1、0·3bg／ml、0．6ug／m1、1.2ug／ml、1．5ug／ml的系列工作液。需当日新配。

(2)测定步骤

①提取和净化 称取组织5．0g，加提取液15．0ml，三氯甲烷5ml，正己烷5nfl，匀浆邙外围冰浴，于10000r／1min下匀浆30s。用5．0ml提取液洗刀头。浆液转入50ml离心管中，振荡10min(稍微快些)，于4000r／min离心10min，把提取液转入第二个50ml离心管平。原匀浆杯用l0．0ml提取液洗，再转人原50ml离心管中，洗残渣，搅匀，振荡5min，；300r／min离心5nfin，吸取提取液于第二个离心管中，合并二次提取液，于4000r／min离心mln，取上清液为样液。

取一定体积的样液过C18萃取柱0.6ml草酸甲醇，0．4ml水洗脱，进HPLC分析。

②测定

a.色谱条件

色谱柱：LUNA C18，5bm，250mmX4．6mm

保护柱：10GC4—ODS：C：s，SGE

柱温；室温

检测波长：360nm

衰减：0．005AUFS

流动相：0．01mol／L草酸液+乙腈+甲醇

流速：1．0ml／min．

进样量；20uL

b．标准曲线的绘制 分别向液相色谱仪注入等体积的系列标准工作液，在上述色谱条件下检测，记录色谱峰面积。通过对药物浓度—峰面积进行回归分析，可获得标准曲线回归方程。

c样液的测定 分析样液按上述色谱条件供液相色谱仪分析。

③空白试验 除不加试样外，按上述测定步骤进行。

(3)灵敏度和回收率

本方法的检测限为50ug／kg。

回收率为70．0％-98．2％。