mRNA差异显示技术(differential display，DD)是用于研究基因的差异表达的新方法。该技术自1992年被首次报道后，即以其不可替代的优势被广泛应用于生物医学领域。在应用过程中不断得到改进，并产生了诸多衍生技术如RPA(RNA finger printing by arbitrarily primed PCR)、GDD(genomic DD)等。本文简要介绍在本试验室荧光标记差异显示技术(fluorescent DD，FDD)的应用及体会。
1.材料与方法
1.1 标本
人单核细胞系U937，细胞密度2×108/L，分对照组(N)、处理Ⅰ组(T1)、处理Ⅱ组(T 2)，N用1640培养基及10%胎牛血清培养，T1用IFN-γ104U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分别刺激7h.
1.2 主要试剂与仪器
TRIzol试剂(GIBCO BRL)、Fluoro DD试剂盒(Genomyx)、Supersript Ⅱ逆转录酶(GIBCO BRL)、Ampli Taq DNA聚合酶(GIBCO BRL)、RNase-free DNaseI(Promega)；Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAThermal Cycler(Perkin Elmer)
1.3 RNA的制备
按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的 RNA以 RNase-free DNase I(终浓度80 000 U/L)除去其中污染的 DNA经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检 测其纯度
1.4 mRNA差异显示
1.4.1 逆转录反应
选择锚定引物[T7(dT12)AP(anchored prime rs，AP)]，序列为5&ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3&，其中 M=A/G/C。N=A /G/C/T]以RNA为模板进行逆转录反应，每管反应体系如下：RNA l.0μg，AP 4 pmol ，70℃ 5 min，加入50 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，75 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，10mmol /L DTT，25μmol/L，dNTPmix(1∶1∶1∶1)，SuperScriptⅡ 60 Units，反应体系20 μl ，42℃ 5 min，50℃ 50 min，70℃ 15 min。
1.4.2 荧光标记差异显示PCR
选取与逆转录引物序列相同的带荧光物 质标记的锚定引物[TMR-T7(dT12)AP]，随机引物(5&ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3&)，以逆转录产物为模板，进行PCR反应。反应体系包括：20 mmol/L Tris-HCl(pH8.4)，50 mmol/L KCl3.75 mmol/L MgCl2，逆转录产物3.0 μl，50 μ mol/L dNTP mi x(1∶1∶1)，0.35 μmol/L 5&-随机引物，0.35 μmol/L 3-锚定引物，Ampli Taq 0.5 U nits，反应体系10 μl。反应步骤如下：95℃ 2 min；94℃ 15 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，4个循环； 94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，个循环；72℃延伸7 min。
1.4.3 分离差异显示片段
配制5.6%变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.2 5 mm，大小61×33 cm。将PCR产物加4.0μl上样缓冲液，95℃变性后上样。3000V、100W 、55℃电泳4.5 h。干胶后置于Genomyx SC扫描，用系统所带的AcquireSC program软件分 析处理扫描结果。
1.4.4 回收差异条带
用AcquireSC软件将差异条带定位，用一次性手术刀片切割下所需条带，置于30μl去离子水中，37℃水浴30-60 min，备用。
1.4.5 差异条带的再扩增
以经上述处理的回收条带为模板，T7启动子22-mer(5>AATACGACTCACTATAGGGC3’)、反M13(-48)24-mer(5&AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3&)为引物，进行再扩增反应：模板2.0μl，20 mmol/L Tris-HCl(pH8.4)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl220 μmol/L dNTP mix(1∶1∶1∶1)，0.2 μmol/L T7、0 .2 μmol/L M13-r、AmpliTaq 1.0 U nits，反应体系20 μl.反应条件同差异显示PCR。
2.结果
2.1 RNA的质量
RNA经Dnase I处理，用1.0%甲醛变性凝胶电泳，可见清楚的28 S、18 S、5 S条带，且28 S/18 S约为2∶1(图1)，表明RNA完整性好，无降解现象。N、T1、T2的OD260/OD28 0比值分别为1.92、1.83、1.98，表明样品纯度高。
Fig.1 Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel
2.2 荧光标记mRNA差异显示
结果显示每一泳道均有约50条大小不等的扩增产物，各组间比较见较多呈有无或强弱变 化的差异条带，图2中箭头所示。
Fig.2 Analysis of gene
2.3 差异条带再扩增
取T2中约1.25Kb的条带再扩增，结果见图3.
Fig.3 Reamplification result of differ entially expressed
band DNA marker is 200 bp ladder (200 bp~2 kb)，1.0kb is arro wed
3. 讨论
基因表达是调节细胞生物学行为的核心。探讨处于不同生理、病理状态下的有机体之间 的未知表达基因的差异，是研究生命本质的有效途径。1992年报道的真核细胞mRNA差异显示技术，为检测未知的表达基因提供了一种新的途径。DD技术具有快速、敏感、 可同时检测两组或以上的组织或细胞、RNA用量少、可检测某一表达基因的有无或其表达的强弱等优点，一经问世即受到许多领域的重视并得以广泛应用。然而，该技术也存在着一些缺陷，主要表现为：cDNA产物的质量较低，在序列胶中往往呈不清晰状态；所得的cDNA片段通常小于500nt，往往是3&-端的非翻译(编码)序列；所得差异片段的假阳性高，可高达85%等。
荧光标记差异显示技术通过对引物设计、PCR条件、凝胶、电泳条件以及标记物的改进，极大减少了上述不足。
差异显示的锚定引物有单碱基锚定引物、简并或非简并的双碱基锚定引物等多种类型，本实验通过使用双碱基锚定引物，将mRNA群体分为12个亚群，这极大减小了每一锚定引物 产生的条cDNA链的数量，不仅可降低随机引物的用量，更可降低DD产物的复杂性，使差示条带在序列胶上易于分辨，从而传统方法中常见的“重叠带”现象减少。DD的随机引物的特点为A+T与G+C含量近乎相等，且3&-端以G或C结尾，可增加DD扩增的效率。通过改变RT-PCR反应条件如底物浓度、延伸时间等，差异片段的长度可达1.0-1.5 kb(图2)， 因较长的cDNA片段容易通过Northern blot 进行分析鉴定辨别真假阳性克隆，且其中可提供更多的序列信息，故获取大的片段具有重要的意义。
文献认为差异显示居高不下的假阳性率实际上因再扩增所致。通常， 再扩增的引物与DD引物相同，本试验将再扩增引物设计为T7(22-mer)与M13-r(24-mer)，此为在锚定引物的5& 端和随机引物的3& 端分别增加的序列(本文方法中所列差异显示引物序列的 划线部分)，这两种来源于原核生物的引物尽可能降低了在真核mRNA序列中非特异性扩增的机会。同时，T7启动子序列可直接用于体外转录合成cRNA探针，为cDNA片段的直接测序和鉴定(RPA或Northern分析)提供了方便。
用常规的序列分析胶进行分辨时，较长的cDNA片段往往挤在胶的上端而影响分辨率。本 操作改用5.6%的PAGE胶(聚丙烯酰胺)，减少胶的厚度(仅250μm)，通过提高电泳的电压(3000 V)及温度(55℃)，可显着提高分辨率。
同位素标记存在曝光时间长、带型不佳，基本与相邻的带混合、污染等缺点，将荧光物 质标记于锚定引物的5’端，可产生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期仅两天。
目前，DD技术己被广泛应用于与疾病、衰老、生殖、生长发育、分化等生理 、病理过程相关的未知表达基因的研究，相信对揭示生物界基因表达调控的奥秘将起重要的作用。
1.4.5 差异条带的再扩增
以经上述处理的回收条带为模板，T7启动子22-mer(5>AATACGACTCACTATAGGGC3’)、反M13(-48)24-mer(5&AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3&)为引物，进行再扩增反应：模板2.0μl，20 mmol/L Tris-HCl(pH8.4)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，20 μmol/L dNTP mix(1∶1∶1∶1)，0.2 μmol/L T7、0 .2 μmol/L M13-r，AmpliTaq 1.0 Units，反应体系20μl。反应条件同差异显示PCR。
2. 结果
2.1 RNA的质量
RNA经Dnase Ⅰ处理，用1.0%甲醛变性凝胶电泳，可见清楚的28 S、18 S、5 S条带 且28 S/18 S约为2∶1(图1)，表明RNA完整性好，无降解现象。N、T1、T2的OD260/OD280比值分别为1.92、1.83、1.98，表明样品纯度高。
Fig.1 Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel
2.2 荧光标记mRNA差异显示
结果显示每一泳道均有约50条大小不等的扩增产物，各组间比较见较多呈有无或强弱变化的差异条带，图2中箭头所示。
Fig.2 Analysis of gene
2.3 差异条带再扩增
取T2中约1.25Kb的条带再扩增，结果见图3。
Fig.3 Reamplification result of differ entially expressedband DNA marker is 200 bp ladder (200 bp~2 kb)，1.0kb is arro wed
3. 讨论
基因表达是调节细胞生物学行为的核心。探讨处于不同生理、病理状态下的有机体之间 的未知表达基因的差异，是研究生命本质的有效途径。1992年报道的真核细胞mRNA差异显示技术，为检测未知的表达基因提供了一种新的途径。DD技术具有快速、敏感、 可同时检测两组或以上的组织或细胞、RNA用量少、可检测某一表达基因的有无或其表达的 强弱等优点，一经问世即受到许多领域的重视并得以广泛应用。然而，该技术也存在着一些 缺陷，主要表现为：cDNA产物的质量较低，在序列胶中往往呈不清晰状态；所得的cDNA片段通常小于500nt往往是3&-端的非翻译(编码)序列；所得差异片段的假阳性高，可高达85%等。
荧光标记差异显示技术通过对引物设计、PCR条件、凝胶、电泳条件以及标记物的改进，极大减少了上述不足。
差异显示的锚定引物有单碱基锚定引物、简并或非简并的双碱基锚定引物等多种类型，本实验通过使用双碱基锚定引物，将mRNA群体分为12个亚群，这极大减小了每一锚定引物产生的条cDNA链的数量，不仅可降低随机引物的用量，更可降低DD产物的复杂性，使差示条带在序列胶上易于分辨，从而传统方法中常见的“重叠带”现象减少。DD的随机引物的特点为A+T与G+C含量近乎相等，且3& 端以G或C结尾，可增加DD扩增的效率。通过改变RT-PCR反应条件如底物浓度、延伸时间等，差异片段的长度可达1.0-1.5 kb(图2)，因较长的cDNA片段容易通过Northern blot 进行分析鉴定辨别真假阳性克隆，且其中可提供更多的序列信息，故获取大的片段具有重要的意义。
文献认为差异显示居高不下的假阳性率实际上因再扩增所致。通常， 再扩增的引物与DD引物相同，本试验将再扩增引物设计为T7(22-mer)与M13-r(24-mer)，此为在锚定引物的5& 端和随机引物的3& 端分别增加的序列，这两种来源于原核生物的引物尽可能降低了在真核mRNA序列中非特异性扩增的机会。同时，T7启动子序列可直接用于体外转录合成cRNA探针，为cDNA片段的直接测序和鉴定(RPA或Northern分析)提供了方便。
用常规的序列分析胶进行分辨时，较长的cDNA片段往往挤在胶的上端而影响分辨率。本操作改用5.6%的PAGE胶(聚丙烯酰胺)，减少胶的厚度(仅250μm)，通过提高电泳的电压(3000 V)及温度(55℃)，可显着提高分辨率。
同位素标记存在曝光时间长、带型不佳，基本与相邻的带混合、污染等缺点，将荧光物质标记于锚定引物的5& 端，可产生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期仅两天。
目前，DD技术己被广泛应用于与疾病、衰老、生殖、生长发育、分化等生理 、病理过程相关的未知表达基因的研究，相信对揭示生物界基因表达调控的奥秘将起重要的作用。
