一、样品提取：三氯醋酸—丙酮沉淀法
(1) 在液氮中研磨叶片
(2) 加入样品
一、样品提取：三氯醋酸—丙酮沉淀法
(1) 在液氮中研磨叶片
(2) 加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。
(3) 加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时)，然后真空干燥沉淀，备用。
(4) 上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4℃待用。
(5) 用Brandford量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
二、一向电泳(13cm的holder)
(1) 取大约70-100ng的蛋白与溶胀液混合体积达到250vl
(2) 将上述溶液加到holder的两个电极之间。
(3) 去掉胶条的保护膜，胶面朝下，先将胶条朝胶条槽的方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，后放下胶条平端，使溶液浸湿整个胶条。
(4) 在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。
(5) 将胶条槽平放于一向仪器上，与水平方向垂直。
(6) 设置仪器的运行参数：
三、胶条的平衡(由一向到二向)
(1) 将胶条放入10ml平衡缓冲液中(加入10mgDTT)封口，在振荡仪上振荡15分钟。
(2) 将胶条取出放入10ml新的平衡缓冲液中(加入250mg的碘乙酰胺)封口，在振荡仪上振荡15分钟。
(3) 用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。
四、二向电泳
(1) 将平衡好的胶条直接转移到第二向制好的SDS胶上，然后用琼脂糖封顶，准备第二向电泳.
(2) 设置仪器的运行参数：
五、平板胶的染色
硝酸银染色：(整个操作在摇床上进行)
(1) 固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml去离子水，60分钟。
(2) 敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸钠(使用之前加入)，17g醋酸钠，165ml去离子水，30分钟。
(3) 清洗：用250ml的去离子水清洗3次每次5分钟。
(4) 银染：0.625g硝酸银，250去离子水，(使用之前配制)20分钟。
(5) 显色：6.25g碳酸钠，100vl的甲醛(使用之前加入)，250ml去离子水。
(6) 终止：5%的醋酸。
(7) 照相分析。
(8) 保存制作干胶。
药品：
提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮
裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
平衡缓冲液：1.5MTris－Cl ph8.8 6.7ml，尿素72.07g ，87％的甘油69ml，SDS 4g，溴酚蓝少许。
溶涨液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚蓝少许溶于无菌水中，体积为25ml。使用之前再加入IPG缓冲液0.5vl/100vl，DTT1.5vl/100vl。
药品配制：
丙烯酰胺单体储液：丙烯酰胺60g甲叉双丙烯酰胺1.6g溶于无菌水中体积200ml
分离胶缓冲液：Tris
10％SDS：SDS5g溶于无菌水中体积50ml
10％的过硫酸胺：0.1g溶于无菌水中体积1ml
SDS电泳缓冲液：Tris
封胶溶液：SDS电泳缓冲液100ml琼脂糖0.5g溴酚蓝少许
注意事项：
1、样品的问题：
样品制备是做好2-d的关键，这句话好象有点多余，如果样品中离子浓度过大，根本做不了2d，我开始的时候由于提取方法有问题，结果浪费了很多时间和IPG胶条，真的很心痛呀！另外再说明一点，好用新鲜的样品提取蛋白质，蛋白点的差异很大，新鲜的样品点多，而我用存放在-80的样品跑出来效果差了很多呀！如果你不确定你的蛋白提的如何，建议你先跑sds-page。检验一下。关于蛋白的提取方法，我还想听听各位的建议。
2、上样量的问题，我觉得我跑的这张2D图，上样量还需要调整，可以适当降低，我的ipg胶条是13厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖，这是讨厌的问题。
3、跑一向的时候大家都差不多，根据公司的说明就可以做了。跑二向的时候我现在一般做恒压，以前做过恒流，没感觉有什么差异，还想请教各位！横流和恒压到底哪个更好一些！
4、ipg胶条ph的选择，我做的是植物的花药，一般情况下酸性端点多一点，碱性端较少，我现在选用的是ph3-10的，我觉得很不合适，(不过这个胶条是免费的)因此好多点没能很好的分开，如果胶条的ph小一点，胶条(我希望能达到18cm)可是我们这里做不了，效果应该比这个好很多的！
5、从这块胶上，我觉得致命点就是背景深，将影响我下一步的分析。所以银染还需要改进！
6、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度也是可以调节的，我比较懒，就作过10%，12.5%的，不过觉得都不适合。
