人和动物体内绝大部分组织都可以在体外培养,但其难易程度与组织类型、分化程度、供体的年龄、元代培养方法等有直接关系,元代取材是进行组织培养的步。
取材的基本要求
(1)却才的组织好尽快培养。因故不能即使培养,可将组织浸泡于培养业内,放置于冰浴或4度冰箱中。如果组织块很大,应先将其切成1cm3以下的小块再低温保存,但时间不能过24h。
(2)取材时应严格无菌操作,用无菌包装的器皿或用事先消毒好的,带少许培养液的小瓶等便于携带的物品取材,取材过程中要尽量避免紫外线照射和接触化学试剂如碘、汞等。从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材时,为减少污染,可用含500~1000单位/ml的青链霉素BSS液漂洗5~10min或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再做培养.
(3)取材和原代培养时要用锋利的器械如刮脸刀片切碎组织尽可能减少对细胞的机械损伤.
(4)对于血液.脂肪.神经组织.结缔组织和 坏死组织取材时要细心出去修剪和切碎过程中为避免组织干燥可将其浸泡于少量培养液中.
(5)原代培养特别是正常细胞的培养应采用营养丰富的培养液好添加胎牛血清含量为10%~20%为宜.
(6)一般来讲胚胎组织较成熟个体的组织容易培养分化底的较分化高的组织容易生长肿瘤组织较正常组织容易培养.如无特殊要求可采用易培养的组织进行培养率较高.
(7)为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养后与原组织的差异性原代取材时要同时留好组织学标本和电镜标本.对组织的来源.部位.包括供体的一般情况要做详细的记录以备以后查询.
取材的基本器材和用品
(1)眼科组织剪.弯镊.手术刀(用前消毒)
(2)装有无血清培养基或Hank's液的小瓶
(3)小烧杯(10ml50ml)
(4)培养皿(特殊用途物品详见后面章节)
皮肤和粘膜的取材
皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要组织来源.一般皮肤黏膜主要取自手术过程中切除的部分组织如特殊需要也可酌情单独取材.方法似外科取断层皮片手术的操作但面积一般2~3mm2即可.这样局部不留疤痕.注意取材时不要用碘酒消毒.
皮肤黏膜培养多是以获取上皮细胞为目的因而无论何种方法取材都不要切取太厚并要尽可能去除所携带的皮下或者黏膜下组织.如欲培养成纤维细胞则反之皮肤.粘膜分布在机体外部或与外界相通的部位故表面细菌.霉菌很多.取材时要严格消毒必要时用较高浓度的 抗菌素溶液漂洗.
内脏和实体瘤的取材
人和动物体内所发生的肿瘤及各脏器是较常用的培养材料.内脏除消化道外基本是无菌的但有些实体瘤有坏死并向外破溃者可能被细菌污染.内脏和实体瘤取材时一定要明确和熟悉自己所需要组织的类型和部位要去除不需要的部分如血管.神经和组织间的结缔组织取肿瘤组织时要尽可能取肿瘤细胞分布较多的部分避开坏死液化部分.但有些复发性.浸润性较强的肿瘤较难取到较为纯净的瘤体组织其肿瘤组织与结缔组织混杂在一起培养后会有很多纤维细胞生长给以后的培养工作增加困难.对于一些特殊细胞培养的取材详见后面的有关章节.
血细胞的取材
血液中的白细胞是很常用的培养材料常用于进行染色体分析.淋巴细胞体外激活进行免疫治疗等.一般多采用静脉取血微量时也可以从指尖或耳垂取血.为防止凝血重用肝素抗凝剂抗凝剂的量以产生抗凝效果的小量为宜量过大易导致溶血.肝素常用浓度为20U/ml抽血前针管也要用浓度较高的肝素(500U/ml)湿润.抽血时要严格无菌.
骨髓.羊水.胸水.腹水内细胞的取材
要根据各种有关操作规程进行.详见以后的章节.这几种样品取材后一般不需要其它处理离心后好立即培养不易低温保存.
鼠胚组织的取材
由于鼠胚组织取材方便易于培养同时与人类相近都是哺乳类动物已成为较常用的培养材料.因为小鼠的毛中隐藏微生物较多而且不易消毒.所以取材时更要注意无菌消毒其无菌消毒一般采用以下方法进行:首先用引颈法杀死动物然后将其整个浸入盛有75%酒精的烧杯中5min注意时间不能太长以免酒精从口和其它孔道进入体内影响组织活力.取出后放在消毒过的小木板上用消毒过的图钉或大头钉将其固定.然后用眼科剪和止血钳剪开皮肤解剖取材.也可在酒精消毒后在动物躯干中部环形剪开皮肤用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾把动物反包暴露躯干然后在固定解剖 取材.区号的组织要放置在另一干净的平皿中或玻璃板上进行原代培养操作.动物消毒后的操作宜在净台内或无菌环境中进行