全血标本DNA PCR反应模板的制备
试剂与配制
蛋白酶K:20mg/L 溶于10mmol/L Tris-HCl pH7.5
TE缓冲液(pH7.5 或8.0)
PBS(磷酸盐缓冲液)
钾缓冲液:50mmol/L KCl,10~20mmol/L Tris-Cl,2.5mmol/L MgCl(pH8.3),1%laureth12,0.5% Tween-20,蛋白酶K(100μg/ml)
裂解缓冲液:0.32mol/L蔗糖,10mmol/L Tris-Cl,5mmol/LMgCl2,1% Triton-100
操作方法
方法一
1. 无菌取血200μl置于含有50μl15%EDTA的EP管中混匀;
2. 12000rpm离心5min,弃上清;
3. 将细胞团悬浮于50μl溶液(10mmol/L Tris-HCl pH7.6,5mmol/L MgCl2, 10mmol/L NaCl) 中,12000rpm离心5s,去上清;
4. 重复 (3) 2~3次;
5. 将沉淀的细胞悬浮于100μl双蒸水中,煮沸5min;
6. 12000r/min离心5min,去细胞碎片;
7. 取上清2~5μl进行PCR扩增。
方法二
1. 取全血50μl于微量离心管中,加入0.5μlTE混匀;
2. 12,000g 离心10s,弃上清,加入0.5μlTE悬浮沉淀,再离心,重复此步骤2次以上;
3. 用100μl钾缓冲液悬浮沉淀,56℃水浴45min,消化细胞;
4. 95℃ 保温10min,灭活蛋白酶K,取10μl上清进行100μl PCR反应。
方法三
1. 在微量离心管中,将0.75ml全血和0.75ml裂解液混匀;
2. 10000g离心30s,去上清,加入1.5ml裂解液悬浮沉淀。重复此步骤2次;