荧光标记的染色体原位杂交技术提供了一种快速而有效的手段,将DNA片断和特定的真核生物细胞的染色体区带联系了起来,并将这些DNA片断排序,这是研究DNA顺序在染色体上位置的直接的方法。早,人们根据Gall和Pardue在1969年的工作,于70年代,建立起了同位素原位杂交技术,但当时只是用于DNA顺序在多线染色体上的定位或是重复顺序在中期染色体上的定位。1981年,Gerhard和Harper等首先证明有可能将从个体基因中得到的单拷贝顺序(SCP,single copy probe)通过同位素原位杂交技术定位到中期染色体上。在此基础上,80年代初起,荧光标记的原位杂交技术开始起步并得到运用且不断地发展。
1.SFIH技术简介
FISH技术包括下列几个步骤:a.探针的准备和标记;b.探针和染色体的杂交;c.信号检测;d.杂
生物素,地谷新(digoxigenin),二硝基苯(dinitrophenyl,DNP),氨基乙酰芴(aminoacetylfuorene,AAF),汞和磺酸盐(sulfonate)。
就掺入方式来说,生物素,地谷新等是以核苷酸衍生物的形式掺入的,可用切口平移法来进行的,现在更多的人开始用随机引物法,用这两种方法标记好的探针大小在200-500bp范围内,是用于杂交的佳大小。另外,也可以在已知顺序的两个引物之间用PCR法来扩增,或从合适的载体上通过rna转录而来。
1.2探针和染色体的杂交
佳杂交条件取决于探针和目标的性质。已标记好的变性的探针(200-500bp)与变性的染色体在含有甲酸胺,盐和硫酸葡萄聚糖的杂交缓冲液中杂交过夜接着是柔和的洗涤,以去除未杂交或错配对的探针。
1.3信号的检测
在洗去未杂交和错配对的探针分子之后,载片培养在免疫荧光试剂中,使其在探针杂交的位置上产生荧光信号,偶联了荧光素分子的抗生物素蛋白被用来标记已掺入到探针分子中的生物素。地谷新,二硝基苯,AFF和硫磺酸盐则可以用相应地标上了荧光素地抗免疫球蛋白来标记。
常用地荧光素分子有FITC,rrhodamine和Texas Red等。
1.4分带和信号定位
染色体地分带可以在杂交前,也可以在杂交后。高分辨的染色体标本是取得好的带形的基础。常用的分带方法有G(giemsa)带、Q(quinacrine)带、R(reverse)带,包括色霉素chromomycin A3/偏端霉素distamycin A法;hoechst33258/propidium iodide