按时间顺序整理

1、 TtT/M-87细胞细胞房和生物安全柜（或净工作台）先开紫外照射30min。作用：对环境灭菌（空气）。（备注：如果着急，至少也要开15分钟）

在做实验之前考虑好需要哪些物品。开始照射之前，将所需要用到的物品都放到生物安全柜（或净工作台）里面。

常用移液枪或电动移液器等，需要在工作台上放置一套设备。

细胞培养箱一般都已经调整好。定期留意一下二氧化碳是否足够。不够及时更换。

2、 显微镜需要定期消毒酒精擦拭。注意：显微镜一般都放在细胞房。

3、 进入实验之前，首先给自己带上拖鞋、头套，口罩，实验服，手套（手套带双层）。注意：手套要将袖口套进去。实验服、拖鞋*是细胞房。

4、 开始操作之前先观察TtT/M-87细胞细胞。

首先观察细胞培养液的颜色。现在的细胞培养液通常都放有酸碱指示剂（绝大部分是酚红）。细胞在培养生长过程中，不断在培养液上清中累积酸性物质，时间长了，培养液变为黄色（同时培养液中营养物质耗尽）。

其次镜下观察TtT/M-87细胞细胞的生长状态是否良好，是否需要传代。如果生长状态不好，需要对培养液进行调整（一般是加大血清浓度）。过于密集出现大片融合或太密集而导致细胞脱落，则进行传代。

如果长势良好，且细胞培养液颜色未发生变化，可以酌情进行1/2、 1/3、1/4换液，也可以全换液。之，视细胞生长情况而定。

5、 TtT/M-87细胞细胞培养预准备：

首先是准备各种溶液。

*是配制溶液过程中要用到的水。水用纯水，高压灭菌之后，再去内毒素。去内毒素方法很多，*简单可以放在烘箱180度3小时。或者过去内毒素的柱子后，高压灭菌。

第二，各种溶液灭菌：

抗生素用去内毒素水配制后，直接过滤除菌（过0.22u滤头）。可以用一次性无菌注射器过一次性0.22u滤头。

现在用的培养液，如果是商业化液体培养基，不用处理。如果是粉末，需要用去内毒素水在生物安全柜（或净工作台）进行配制，再过滤除菌。可以先配浓缩液（如10×），过滤除菌后。再用灭菌去内毒素水稀释成1×培养液。

第三，完全培养液的配制：

培养液加上合适比例的血清即可。但血清一般保存于－20℃，一般解冻是放在4℃冰箱解冻，耗时长，而且必须解决完全之后，才能进行完全培养基的配制。所以要提前几个小时就将血清从－20℃转入4℃，以期完全解冻。当然如果这一次就需要用完的话（是指用这些血清配制的培养液都用完），也可以放到37℃解冻。

第四，*重要的是保证过程中无菌。

液体必须要分装。无论过程中用到的培养液、胰酶、血清、PBS、生理盐水、抗生素尽量分装。分装是为了防止污染。如果操作有误，仅能威胁到其中一支，而非整个。

培养液、血清、PBS、生理盐水分装为20mL、50mL或100mL/管

胰酶、抗生素可分装为1mL/管。

分装*先于TtT/M-87细胞细胞操作

第五，操作之前，培养液先放到37度的细胞培养箱里复温。原因：尽量减少对细胞的刺激。低温对于细胞也是一个刺激因素。

第六，操作之前，大脑先过一遍此次操作所需要用到的所有用具。将所有用具先放到无菌台面上。减少拿入拿出的动作，保证无菌。（如果万一发现少拿了什么，也不要紧，再加上就是。如果是枪头盒、移液管等用具，*先用消毒酒精喷一下）。

第七，操作之前，带着的手套先喷消毒酒精。然后再进入工作台。等一分钟，等手套上的酒精挥发之后再进行操作。

6、 TtT/M-87细胞细胞培养操作过程：

注意无菌。无论哪一管液体，开盖后尽量立即关上（如果有几瓶都需要开的，也注意，可以虚盖）。盖子向上放。操作时不要从开盖的容器上方经过。另外，无菌台面上摆放的各种东西，*是一字摆开，平行于自己。尽量不要前后重叠。

TtT/M-87细胞细胞操作中所用的所有耗材试剂*都是细胞培养。一般都以一次性耗材居多。1ML枪头为加长型培养枪头。移液管亦有10mL一次性无菌移液管

（1）细胞换液：

培养皿/瓶用枪头或移液管吸去原培养液，加入新培养液。

（2）细胞传代：

传代之前先观察，细胞是否密集，是否开始融合。一般融合达到70－80%就可以传代。早点传代也可以。

如果是贴壁生长的细胞：

1） 培养皿/瓶用枪头或移液管吸去原培养液；

2） 无菌PBS或无菌生理盐水洗涤3次（按培养体积加入）；

3） 加入适量胰酶消化适当时间（一般胰酶为0.25%；9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶，一次加入1mL胰酶。消化时间视细胞类型等多种情况综合考虑，一般如果是细胞株，非原代培养，消化1－2分钟足矣）；

4） 用枪头吹打数十次（视细胞类型而定。一般细胞株30－50次吧，耗时一般2分钟左右）；

5） 加入适量体积完全培养基终止胰酶消化（如果是9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶，可以加入1mL完全培养基；现在培养瓶（皿）里有2mL溶液）。

6） 现在可以将溶液进行分瓶（2mL）。如果是细胞株，直接均分到两个培养瓶（皿）里。如果是原代培养，可以根据消化时间来对细胞进行分离；因此可以将溶液（2mL）都转入新的培养瓶（皿）。

7） 将两个培养瓶（皿）补足完全培养基到正常体积（果是9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶，为5mL完全培养液）

8） 镜下观察。刚刚传代细胞还没贴壁，悬浮在溶液中，呈圆形。一般2h之内会贴壁，如果已经贴壁，根据细胞类型有不同的形态，但通常都不是圆形。

9） 镜下观察无误之后，再放入细胞培养箱。培养瓶（皿）放入之前，可以用消毒酒精先擦一下。

10） 传代之后，*第二天细胞换液一次。当然，也可以视情况而定。

7、 收拾工作台。物品归位，倒出垃圾。再开紫外照射30min

8、 TtT/M-87细胞其它注意事项：

*，经常观察。*是每天都显微镜下看一看，确定细胞状态。然后该换液换，该传代传，不用理会的就原样放回去。如果好几天都不想理会，可以放不完全培养基，或者低血清浓度的培养液，维持细胞生存，但不增殖。

第二，是否加抗生素。这个视情况而定。细胞培养过程中，是要求尽量少添加不相关的杂质。抗生素对于细胞来说，也是一种负担。但如果环境比较污染，直接添加好了。好比没病不用吃药，感冒了还是要吃药；婴儿没病但还是要打疫苗。

第三，胎牛血清的解冻。血清一般保存于－20℃，要放在4℃冰箱解冻，耗时长，500mL要好几个小时，我们经常是头天离开实验室之前放到4℃冰箱，*。所以经常分装成10mL或者20mL。这样，上午放到4℃冰箱，下午就可以用了。

第二，是否一定要细胞房。以及是否要完全严格的遵守种种器具。这个吧，见仁见智。凡所有种种措施及设备都是为了保证培养操作过程中无菌，减少感染的机率；试剂耗材保证无菌无内毒素。细胞房也是这么一个措施而已，其它试剂耗材也是；我们没有专门的细胞房也这么养。

并不是说走夜路就一定会遇到鬼，当然走多了迟早遇到，如果是遇不到，这个人运气一定很好——可以去买彩票。

刚开始我们实验室也是没有的生物安全柜和细胞房，拖鞋什么的也没办法，没有加抗生素，照样养得好好的。但是，交叉养，还是需要注意，一是时间上分隔开来：每天细胞培养先操作。其它细菌之类操作靠后，且操作后消毒酒精台面消毒，紫外照射1小时。二是其它操作要小心，避免带入污染。当然，如果有必要加抗生素，还是尽早加，比细胞污染了再去抢救要来得好。

（算是顺便整理了一下，属于入门级别的。）

@geraldorjerry：你好，你的意思是紫外线照过之后，实验操作开始了，如果万一发现少拿了什么，就直接酒精喷一下再放进去是吗

@llh1245：有时确实是忘记，*怕的就是那种实验已经做到一半忘记了的，或者发现东西不够用的。我们一般是这样处理：耗材、移液枪还有金属器皿之类的，可以喷一下酒精放进来，等酒精风干一下，注意不要和其它东西混杂。反正一般细胞的也有外包装，里面已经是无菌无内毒素。如果是试剂，那就是直接从冰箱拿出来放进来就是。（如果只是实验还没有真的开始，把漏掉的东西加上，再照30分钟就是。）

@姚丽佳：请问TtT/M-87细胞传代前，经过胰酶处理后，加了培养基后不用离心直接分瓶吗？那后面培养的时候不就含有胰蛋白酶了吗？不会产生影响吗？

@llh1245：是的，不用离心直接分瓶。之后加入含血清的培养基中止了胰酶作用。如果是贴壁细胞，一般第二天就贴壁了。分瓶后第二天再全部换液。如果是半悬浮细胞，一般都不用胰酶消化，都是直接吹下来。

1.【无菌环境】 在TtT/M-87细胞细胞实验之前要注意无菌环境的建立，紫外杀毒灭菌，酒精消毒都是十分有必要的。

2.【镜下检查】 镜下检查结果非常重要，镜检的结果非常重要，要根据你自己的观察进行细胞密度的识别，从而进行细胞传代比例的确定，进行更好的细胞数量的控制，如果实验要求比较高，需要细胞计数板计数。

3.【过火焰】

记住，所有开瓶的东西都要进行过酒精灯外焰，瞬间高温进行灰尘的固定。这样会大大减少染菌几率。

4.【移液工具】

很多人对于移液工具都有偏好，不好说什么就是正确的。但是从无菌角度。使用移液管比微量移液枪减少污染的几率要高。希望大家能用移液管。

5.【交叉污染】

混匀细胞悬液和移取培养基以及血清的工具要分开；还有就是胰酶和血清也要严格分开，否则容易造成交叉感染，使细胞增加染菌几率。

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6.【消化时间】

对于贴壁细胞，我想要大家注意的是胰酶消化时间，对于常用0.25%的胰酶*把消化时间控制在30s内，必要是*镜检看一下是否脱壁。但是这是一个经验活，要多积累经验。

7.【细胞混匀】

TtT/M-87细胞细胞的混匀要轻柔，气泡的产生对细胞的状态是有影响的，希望大家注意。另外，贴壁细胞容易粘连，所以要多吹打几次。