人小细胞肺癌细胞的培养操作与应用！
一、背景
人小细胞肺癌细胞是人小细胞肺癌细胞上皮样细胞，STR检测发现该细胞与另外两株肺癌细胞LTEP-a2、LTEP-a3为同一遗传背景，怀疑存在细胞间的交叉污染。
二、人小细胞肺癌细胞的培养操作
1、复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养*（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养*）。第二天换液并检查细胞密度。
2、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
⑴弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
⑵加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
⑶按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
⑷将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
⑴细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
⑵4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
⑶将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、人小细胞肺癌细胞的应用
用于Wentilactone A对小细胞肺癌增殖抑制和诱导凋亡的分子机制研究
通过检测WA对NCI-H446、NCI-H1688、LTEP-sm三种SCLC细胞株增殖和凋亡的影响,采用人全基因组表达谱芯片筛选、基因功能获得和干扰、Western Blot、流式细胞术等实验分析WA作用的分子机制,希望能进一步揭示WA抑制SCLC细胞株增殖的分子机制,为WA的临床应用奠定基础。
Wentilactone A诱导细胞凋亡抑制SCLC增殖的研究为了研究WA对SCLC细胞株增殖的影响,本部分选取三株SCLC细胞株NCI-H446、NCI-H1688、LTEP-sm为研究对象,通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验、流式细胞术、Western Blot、裸鼠移植瘤模型等实验进行研究。
CCK-8细胞增殖实验结果表明：WA能强烈抑制SCLC细胞株NCI-H446、NCI-1688、LTEP-sm增殖,且抑制作用具有时间和剂量依赖性。流式细胞术检测细胞凋亡的实验结果表明:WA能诱导SCLC细胞株NCI-H446、NCI-H1688、LTEP-sm凋亡,且具有时间依赖性。Western Blot结果表明:10μM WA作用后,三种SCLC细胞株中凋亡抑制蛋白c-FLIP表达都降低,凋亡蛋白c-caspase-3表达增加。
裸鼠移植瘤模型结果表明：WA能抑制NCI-H446细胞裸鼠移植瘤的生长。此外,细胞划痕实验结果表明WA还能能抑制这三种SCLC细胞株的迁移。综上所述,体外和体内实验结果均表明WA具有抑制SCLC细胞株增殖、迁移,诱导SCLC细胞株凋亡的活性。
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