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细胞培养指南——技术和方案

哺乳动物细胞组织培养技术指南。涵盖大量关于哺乳动物细胞系的维持、分裂和细胞保存的信息。请注意，有细胞培养必须使用无菌技术在层流罩中进行。

1.引言

细胞培养是细胞和分子生物学中使用的关键工具，可以对细胞的生理学和生物化学进行建模。此外，细胞培养使研究人员能够确定药物和有毒化合物对细胞反应的影响。由于使用一批克隆细胞可获得一致和可重复的结果，细胞培养仍然是当今研究中使用*广泛的技术。

来自动物或植物的细胞在有利环境中的生长被称为细胞培养。不同的细胞有不同的培养要求，为了达到*的生长效果，可以通过培养基的选择和补充剂来满足。用介质的作用是提供必需的营养物质（氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质）、生长因子、激素、气体（O2、 CO2），并调节物理化学环境（pH值、渗透压、温度）。

1.2 原代培养vs细胞系

原代培养是指在组织分离后直接进行培养的细胞。一旦这些细胞汇合，即会占据烧瓶中有可用空间，此时就需要将它们转移到一个新的生长容器中进行传代或分割，这将为细胞提供更多的继续生长和扩展的空间。*次传代后，原代培养现在成为谓的细胞系。源自原代培养的细胞系寿命有限，这意味着它们在衰老之前只能分裂有限的次数。

由于细胞被传代，生长能力*强的细胞占优势，导致群体的基因型和表型一致。永生细胞系广泛用于细胞和分子生物学，以绕过衰老等问题。细胞可以通过多种不同方式转化并永生。自发地、化学地或病毒地。一旦转化，这些细胞就获得了无限分裂的能力，成为一个连续的细胞系。

1.3 贴壁细胞和悬浮细胞

细胞系可以是：

1.贴壁（贴壁依赖性）——贴壁细胞必须在附着于固体或半固体底物上时进行培养，通常需要胰蛋白酶法进行亚培养（更多信息请参见2.6）。

2.悬浮（与锚固无关）——悬浮细胞不需要固体生长底物，可以悬浮在培养基中生长。

2. 细胞培养指南

以下是细胞系培养的通用指南。有细胞培养必须在微生物安全柜中进行，使用无菌技术确保无菌。研究人员必须全程穿着防护服。

2.1 无菌技术和层流罩的制备

良好的无菌技术旨在创建无菌环境，并充当微生物与无菌细胞培养罩之间的屏障。该技术的关键包括使用无菌试剂和培养基。无菌操作确保未经过70%乙醇喷洒过的任何物体进入罩内。

层流罩制备

细胞培养罩可提供无菌工作区，同时可确保控制微生物程序产生的任何传染性飞溅物或气溶胶。细胞培养罩有3种类型，分别为I级、II级和III级，这些都是为了满足不同的研究和生物安全需求而开发的。请根据实验需求选择合适的产品。

使用层流罩

步骤

程序

取下盖子并打开层流罩。

将层流罩窗扇关闭至适当位置，以保持层流空气。

用70%的乙醇喷洒层流罩的有表面区域。

避免混乱。

确保有使用的设备（即移液器吸头、移液器、机架、Eppendorf管、烧瓶、试剂）是无菌的，然后再把它们放在罩子里。这可以通过高压灭菌或通过使用购买的预高压灭菌的不含DNAse / RNAse的设备来完成。用70％乙醇喷洒移液器和机架。

有介质、补充剂和试剂必须无菌，以防止微生物在细胞培养物中生长。如果一些试剂和补充剂没有提供无菌，将需要对它们进行过滤消毒。

避免直接从瓶或烧瓶中倒入介质和试剂。

每个移液器只使用一次，以避免交叉污染。

在准备使用移液器，并在罩内进行之前，不要拆开无菌移液器的包装。

10.

只有在准备使用时才可以揭开无菌烧瓶、瓶子、培养皿等的盖子，切勿让其暴露在环境中。使用完后应立即将盖子放回原处。

11.

如果要取下盖子，并且必须将其放在工作面上，则将盖子的开口朝上放置。

2.2 细胞生长培养基的制备

在开始之前，确保针对感目标细胞系使用正确的培养基类型和培养补充剂。这些必须始终是无菌的，并且只能在罩内打开。大多数细胞系可以使用Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)培养基或含10％胎牛血清（FBS）的Roswell Park Memorial Institute (RPMI)培养基。如果需要，可以添加2mM 谷氨酰胺和抗生素。

如何准备DMEM介质

步骤	程序
1.	从500mL的瓶子中取出50mL的介质。
2.	现在的体积为450mL。
3.	加入10％FBS = 50mL。
4.	加入补充剂2 mM谷氨酰胺= 5mL，100 U青霉素/ 0.1mg/mL链霉素=5mL。

2.3 创造正确的培养环境

某些内皮细胞系需要特殊的胶原蛋白基质才能生长。这些基质确保细胞系的附着、分化和生长。在开始细胞培养实验之前，重要的是对目标胞系进行文献调查，以确保满足任何额外的生长要求，如基质。请注意用*类型，即通气或不通气。如果使用非通气/塞瓶烧瓶，请确保松开盖子以进行气体交换。如果使用通气烧瓶，请确保过滤器不会弄湿，因为这会影响气体交换的效率。

如何为内皮和上皮细胞制备1％明胶基质

步骤	程序
1.	通过用蒸馏水稀释，然后过滤，制备10mL的由1％明胶/1％纤连蛋白组成的包衣溶液。
2.	这可覆盖约5个烧瓶。
3.	吸取包衣溶液到烧瓶中
4.	来回摇动以将基质均匀分布在烧瓶上。
5.	放在培养箱中静置15-30分钟
6.	在接种前用吸气的方法清除包衣溶液。

2.4 检查细胞

每天应在显微镜下检查细胞，以确保它们健康并按预期生长。熟悉显微镜下健康细胞的外观非常重要，因为这将使通过形态变化检测静止或感染的细胞更加容易。

如果出现以下情况，请丢弃细胞：

步骤	程序
1.	介质从粉红色/红色变为暗黄色。这是感染的迹象，并使用无菌技术。
2.	如果贴壁细胞大量脱落，则表明细胞死亡。
3.	如果细胞的外观发生了显着变化——看起来散乱而呈现颗粒状。
4.	如果它们静止。

2.5 分裂细胞

哺乳动物细胞汇合时应分裂/传代，这在烧瓶中70-80％的面积被细胞覆盖时发生。在贴壁细胞中，当没有可见的空间可用于细胞生长时，可以在显微镜下观察到汇合。对于悬浮细胞，当细胞凝聚在一起时，可以注意到汇合，并且当烧瓶旋转时，培养基看起来会混浊。

重要的是，不要让细胞过度汇合，以70-80％的汇合为*量，在这种情况下，接触抑制作用开始生效，并且细胞在重新接种后需要更长的恢复时间。细胞系生长的速度将决定使用的分裂比。例如，如果以高比例分裂，生长缓慢的细胞系将不能很好地发挥作用。

快速生长的细胞系可能需要较高的分裂比例，因为与生长较慢的细胞系相比，它们需要更短的时间达到汇合。通常，细胞分裂的比例不应过1:10，因为这对于细胞而言太低，将是细胞无法生存。改变培养物的接种密度可确保细胞在特定的*准备好进行实验。

作为通用指南，一个汇合烧瓶中的细胞：70-80％的汇合分裂比例应为1：2，并准备在1-2天进行实验。70-80％的汇合分裂比例应为1：5，并准备在2-4天进行实验。70-80％的汇合分裂比例应为1：10，并准备在4-6天进行亚培养或电镀。但这可能取决于细胞系的生长速率。

细胞培养指南-技术和方案

图1：细胞培养物稀释液1

细胞培养指南-技术和方案

图2：细胞培养物稀释液2

2.6 分裂细胞方案

步骤	程序
1.	确保细胞至少汇合80％。
2.	将新鲜细胞培养基在37℃的水浴或培养箱中加热至少30分钟。
3.	确保烧瓶正确标有代号、细胞系、分裂比例和日期。
4.	准备一个装有漂白剂的废料容器，以容纳大约100mL的10％次氯酸钠废液。

2.6.1 对于松散粘附的细胞（细胞刮除）

步骤	程序
1.	小心地将介质倒入垃圾箱。
2.	在烧瓶中加入等体积的预热新鲜培养基。
3.	使用细胞刮刀将细胞从烧瓶底部轻轻刮入培养基中。
4.	确保已从烧瓶上刮下有细胞。
5.	使用血清移液器取出需量的细胞悬液。例如，对于1：2分裂，从100mL中取出50mL倒入新的烧瓶中；对于1：5分裂，从100mL中取出20mL倒入新的烧瓶中；对于1：10分裂，从100mL中取出10mL倒入新的烧瓶中；
6.	将需的体积（考虑分裂比例）添加到预热的新鲜培养基中。例如在25cm2的烧瓶中加入约5-10mL；75cm2的烧瓶中加入约10-30mL；175cm2的烧瓶中加入约40-150mL。

2.6.2 对于贴壁细胞（胰蛋白酶）

步骤	程序
1.	小心地将介质从烧瓶中倒入废液容器。
2.	使用无菌技术，将预热的PBS移液到烧瓶中，以洗涤细胞并除去任何残留的介质和FBS。
3.	轻轻前后摇动烧瓶，用PBS冲洗细胞，然后倒入废液容器中。重复3次。除去任何残留的FBS对于有效的胰蛋白酶消化很重要。
4.	洗涤完成后，添加胰蛋白酶EDTA（也已预热）。应该使用足够的胰蛋白酶以覆盖细胞。对于25cm2的烧瓶约1mL；75cm2的烧瓶约5mL；175cm2的烧瓶约10mL。
5.	像使用PBS一样，轻轻摇动烧瓶，以确保胰蛋白酶与有细胞接触。
6.	将烧瓶放入37℃的培养箱中。不同的细胞系需要不同的胰蛋白酶消化时间。为避免过度胰蛋白酶消化严重破坏细胞，必须在显微镜下每隔几分钟检查一次，同时轻敲烧瓶以使细胞脱落。
7.	一旦细胞脱落，向烧瓶中加入一些培养基。培养基中的FBS将使胰蛋白酶失活。
8.	轻轻地在烧瓶壁上上下移液，以去除有其他粘附细胞。
9.	计数细胞，将需体积的细胞移液到新的烧瓶中。然后应在这些烧瓶中加满培养基至需体积。例如在25cm2的烧瓶中加入约5-10mL；75cm2的烧瓶中加u人约10-30mL；175cm2的烧瓶中加入约40-150mL。
10.	*放置细胞以使其恢复并稳定下来。

* 胰蛋白酶消化可能对有些细胞有毒。它还可以诱导某些膜蛋白的暂时内在化，在设计实验时应予以考虑。在这些情况下，通常可以使用其他方法（例如温和的细胞刮擦或使用清洁剂）代替。

2.6.3 对于悬浮细胞

步骤	程序
1.	一些悬浮细胞系有建议的分裂比例或传代细胞密度。开始实验之前请检查相关内容。
2.	使用移液器从烧瓶中取出需量的细胞悬液，然后放入新的烧瓶中。例如，对于1：2分裂，从100mL细胞悬液中取出50mL；对于1：5分裂，从100mL细胞悬液中取出20mL
3.	将需量的预热细胞培养基添加到新鲜的烧瓶中。例如，对于1：2分裂，从100mL细胞悬液中取出的50mL，加入50mLs的新鲜介质。对于1：5分裂，从100mL细胞悬液中取出的20mL，加入80mLs的新鲜介质。

2.7 更换介质

如果细胞已经生长了几天，但汇合程度不足以分裂，则必须更换介质以补充营养并保持pH值。

对于贴壁细胞

步骤	程序
1.	在水浴箱或培养箱中使用介质之前，对其预热至少30分钟。
2.	将旧介质倒入垃圾箱。
3.	用相同体积预热过的新培养基更换，然后放回培养箱。

对于悬浮细胞

步骤	程序
1.	在水浴箱或培养箱中使用介质之前，对其预热至少30分钟。
2.	将含有细胞的介质倒入15mL或50mL的离心管中并离心。转速和离心时间可能会因细胞系而异。
3.	离心后，细胞应会沉淀在管的底部，将旧介质倒入废物中，然后将沉淀重新悬浮在相同体积的介质中。
4.	放入新鲜的烧瓶中，并放回培养箱。

2.8 传代数

传代数是细胞经历的传代培养的次数。应记录传代数并且传代数不应太高。与低传代细胞相比，传代数大于30的细胞系更有可能获得遗传异常（Esquenet et al., 1997; Lin et al., 2003; O’Driscoll et al., 2006）。

P30通常被认为是培养中某些细胞传代的上限，因为进一步培养可能会导致分子谱的显着变化，限制其在体内的应用和可重复性（Calles et al., 2006; O’Driscoll et al., 2006; Wenger et al., 2004）。

2.9 冷冻细胞

冷冻细胞系是细胞培养的重要组成部分，因为更换细胞系既昂贵又费时，而且还可以确保如果细胞被感染，还将拥有备用库存并可以重新开始。一旦有多余的细胞可用，*是低传代数以限制遗传漂变，就应将其冷冻为接种库存。然后可以从接种库存中准备使用的细胞。

冷冻保存细胞的*和*广泛使用的方法是将它们保存在带有冷冻保护剂，例如二甲基亚砜（DMSO）的液氮中。冷冻保护剂（例如DMSO）降低了培养基的凝固点并降低了冷却速度，从而大大降低了冰晶形成的风险，而该冰晶会导致细胞死亡和损坏。配置细胞冻存液需要培养基，血清和DMSO，按照一定比例配置。费事费时费力。靶点科技有现成直接使用的Bambanker无血清细胞冻存液（货号BB01），可以直接放到-80，无需梯度程序降温。

冷冻细胞方案

步骤	程序
1.	通过细胞计数和需的冷冻培养基体积确定活细胞数。
2.	离心细胞悬液。离心速度和持续时间会因细胞类型而异。
3.	不干扰沉淀的情况下，将上清液倒入废物中。
4.	根据特定细胞类型建议的活细胞密度，将沉淀重悬于冷的冷冻培养基中。
5.	将细胞悬液分装到低温储存瓶中，清楚标明日期、细胞类型和传代号。
6.	在控制速率的冷冻设备中冷冻细胞，每分钟降低温度约1℃。或者，将含有细胞的冷冻管放在异丙醇室中，并在–80℃下储存*。
7.	将冷冻的细胞转移到液氮中，并在液氮上方的气相中进行存储。

*以尽可能高的浓度和尽可能低的传代数冷冻培养的细胞。冷冻之前，请确保至少有90％的细胞能够存活。始终使用无菌冷冻管保存冷冻细胞。始终使用适当的无菌技术，并在层流罩中工作。

安全注意事项：使用DMSO时应格外小心，因其会促进有机分子进入组织。处理该试剂时，请戴手套并穿着适当的防护服。按照当地法规处理试剂。

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发布时间：2021-07-23