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英文简称:PA317细胞1．本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法；
2．所使用的盖玻片应该为玻璃制造，并经过铬酸洗液处理；
3．盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻；
4．如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率；
5．如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。
实验事项：
1. 试剂准备：所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。
2. 加样：加样或加试剂时，请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，前一个孔与后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育"时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间(包括标准品及所有样品)好控制在10分钟内，如标本数量多，使用多道移液器加样。
3. 孵育：为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。
4. 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响后的酶标仪读数。
5. 试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请确配置标准品及工作液，尽量不要微量配置(如吸取检测溶液A时，一次不要小于10μl)，以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。
6. 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如，每隔10分钟)，如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
7. 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请后乘以稀释倍数。
培养步骤：对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察Ⅱ型肺泡上皮细胞|细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：
方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
Microcephalin 1/BRIT1 英文名称： 小脑症基因1/认知相关蛋白抗体 0.2ml
Miz1/ZNF60 英文名称： 锌指蛋白60抗体 0.2ml
PA317细胞MYO6 英文名称： 肌球蛋白6抗体 0.2ml
Musclin 英文名称： 肌肉素抗体 0.2ml
MGLUR3 英文名称： 代谢型谷氨酸受体-3抗体 0.2ml
MGLUR2 + MGLUR3 英文名称： 促代谢型谷氨酸受体2+3抗体 0.2ml
MGLUR1 + MGLUR5 英文名称： 促代谢型谷氨酸受体1+5抗体 0.2ml
MICA 英文名称： MHC I类链相关蛋白A/组织相容性复合物MHCIa抗体 0.1ml
MURF2 英文名称： 肌肉特异性环指蛋白2抗体 0.2ml
MURF3 英文名称： 肌肉特异性环指蛋白3抗体 0.2ml
phospho-MST1R(Tyr1353) 英文名称： 磷酸化原癌基因c-Met相关酪氨酸激酶抗体 0.1ml
MAPK13 英文名称： 丝裂原活化蛋白激酶13抗体 0.2ml
Multicilin 英文名称： 多纤毛素蛋白抗体 0.2ml
MTMR8 英文名称： 肌管素相关蛋白8抗体 0.2ml
MRC2 英文名称： 巨噬细胞甘露糖受体2抗体 0.1ml
MNAT1 英文名称： 细胞周期G1的相互作用蛋白抗体 0.2ml
MAML3 英文名称： 主导控制样蛋白3抗体 0.2ml
MEK3 英文名称： 丝裂原活化蛋白激酶MKK3抗体 0.1ml
MYSM1 英文名称： MYSM1抗体 0.1ml
MCT1 英文名称： 单羧酸转运蛋白-1抗体 0.2ml
操作流程：
1.1主要试剂与仪器：倒置相差显微镜（日本 olympus imt-413），co2孵箱（日本yamato it-61）。
1.2 hek-293细胞的复苏培养传代及冻存：
1.2.1 细胞的复苏培养 从液氮罐中取出冻存管,立即投入37℃水浴,并不断的摇动,使之迅速融化。 将溶解的细胞冻存管取出,用酒精消毒后打开,吸出溶有细胞的冻存液,加入事先装好培养液（37℃预热，8～10倍体积）离心管内,稍微吹打混匀,然后1000rpm 5min,去除上清,加入适量培养液,吹打成细胞悬液, 以1×105/ml密度接种于25cm2培养瓶内，在37℃、5％co2及饱和湿度下培养。
1.2.2 细胞传代 原代培养的hek－293细胞48h换液1次，细胞长至60%～70%融合时，用0.25%胰酶消化1～2min，将培养瓶再用手掌轻轻敲打使细胞脱壁、悬浮、分散，为使细胞进一步分散可用吹打管轻轻吹打几次，获得细胞悬液，然后加入倍量的培养基，温和混匀，吸管分装混合液，传代扩增细胞。
1.3 细胞形态的观察 在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况及形态特征。
1.4 细胞的计数 常规消化细胞，待细胞变圆、脱壁并浮起，加入少量培养基离心，再用pbs重悬并吹打制成细胞悬液。在细胞计数板盖玻片的一侧加微量细胞悬液，用10×物镜观察计数板四角大方格细胞数，按公式计算出细胞数。细胞数/ml原液＝(四方格细胞数之和/4) ×104。
1.5 细胞的贴壁率 指数生长期的细胞，以0.25％胰酶消化成单细胞悬液，计数后分别接种于12个25cm2培养瓶中，每两小时随机取出3瓶细胞，吸除培养基及未贴壁细胞，加入胰消化酶消化、计数已贴壁细胞，取其平均值，按照公式：贴壁率(%)=(已贴壁细胞数/接种细胞数) ×100％，计算贴壁率。
1.6 生长曲线 取指数生长期的细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，以1×104/孔接种于24孔板，每孔加入1ml培养基。每天随机取3孔，计数每孔细胞的数目并计算平均值。连续计数10d，绘制细胞生长曲线。
