病毒的鉴定方法
圣宾仪器科技上海有限公司
从培养的细胞中分离病毒，然后采用免疫荧光和分子生物学技术进行病毒核酸检测已被*第用于病毒的鉴定。目前常用的病毒定量检测方法有以下三大类：用与病毒感染力检测的技术，如病毒孔板形成实验，半数组织培养感染剂量TCID50测定和免疫荧光等；病毒核酸和病毒蛋白检测技术，如实时定量多聚酶链反应（qPCR），免疫印迹。免疫沉淀，酶联免疫吸附测定（ELISA)和血凝试验等。还有就是那些直接对病毒颗粒进行计数的方法，如流式细胞分析或投射电镜技术。
小编和大家介绍一下病毒空斑形成实验：
原理
病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由*初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。一个蚀斑是由*初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，接种的病毒液要充分分散和稀释。
流程
1. 铺板
将已长满80~90%RDcell消化均匀铺于6孔板中。
2. 病毒感染
细胞长成单层达80~90%吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度，并向每孔中加入200μL 稀释好的病毒液（阴性对照加DMEM200μL ），置于37℃温箱吸附两小时后弃残液。
3. 制备2%琼脂糖
使用低熔点琼脂糖配方：0.2g 加入10ml 无菌PBS 中，121℃高压灭菌15min ，取出后置于55℃水浴锅中待用
4. 混合
将上述琼脂糖和2X ？维持液(FBS浓度为2%）40~50℃水浴1:1混合后，加入培养板各孔，每孔2ml, 室温放置30min 以上使其冷却凝固成覆盖层
5. 培养
把培养板倒置？，在37℃二氧化碳培养箱继续培养48h 。
6. 染色
制备含0.2%结晶紫(生理盐水稀释）的2%琼脂糖：双倍维持液（1：1），置于40~50℃水浴待用，吸取上述混合液加入培养板各孔，每孔2ml, 使冷却凝固成第二覆盖层
7. 培养
把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养48h 观察，每皿蚀斑数量＜10个的稀释度中，挑选附近10mm 均为健康的蚀斑。
8. 将挑选的病毒至少再传2代
有一个问题是，会不会出现多个感染性颗粒同时形成一个空斑呢？
为了回答这个问题，10种基因标记的脊髓灰质炎病毒（polioviruses）混合后进行空斑实验。在形成的123个空斑中，有6个（4.9%）空斑包含不止一个病毒。对脊髓灰质炎病毒进行表型标记可以得到相似的结果。对病毒进行进一步的电镜观察，发现病毒有单个颗粒的，也有2至10个病毒颗粒形成的聚集体。低pH会导致病毒颗粒的聚集，从而增加了共感染发生的概率。用诱变处理后的脊髓灰质炎病毒再进行空斑实验，增加了共感染发生的频率。这可能是因为两种基因缺陷病毒的重组和互补可以恢复诱变。
那这是否就说明脊髓灰质炎病毒的空斑形成实验并不遵守one-hit kinetic（空斑数与病毒颗粒数直接成正比）呢？上面的实验并没有说明，对于没有经诱变处理的病毒，每个空斑的形成需要不止一个病毒颗粒。它只是说明只有一小部分的空斑包含了不止一个病毒。这5%-7%包含不止一个病毒的空斑很可能是病毒体聚集的结果。提示我们可以用不包含聚集体的病毒进行空斑实验，来观察是否有共感染空斑的形成。
一些植物病毒和菌类病毒遵守two-hit kinetics：感染的形成需要含有不同基因组的两种病毒颗粒同时存在，此时空斑数与病毒浓度的平方成比例，此时病毒浓度与空斑数量之间是曲线。显然，只有脊髓灰质炎病毒只有5%-7%的空斑包含不止一个病毒，这也只能让它的直线稍微微偏一点，不会形成曲线!
那么这种现象对于我们用空斑实验来纯化病毒有什么启示呢？尽管这种多个病毒形成一个空斑的比例很低，我们仍有可能挑中那个包含多个病毒颗粒的空斑。所以，做做空斑纯化病毒时至少重复实验三次，以避免此种情况的发生。
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