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一、流动相性质要求
高效液相色谱仪(HPLC)中，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量因子k值减小；较弱的溶剂使溶质在填料表面的吸附增加，相应的容量因子k值增大。因此，k值是流动相组成的函数。理论塔板数一般与流动相的粘度成反比。
1、流动相应不改变填料的任何性质：低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝和氧化镁等吸附剂的柱系统。
2、纯度高：色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
3、必须与检测器匹配：当使用UVD时，所用流动相在检测波长下应没有吸收或吸收很小；当使用RID时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
4、粘度低：高粘度溶剂会影响溶质的扩散和传质，使柱效降低，还会使柱压增加，分离时间延长。*选择沸点在100℃以下的流动相。
5、对样品的溶解度要适宜：如果溶解度欠佳，样品会在色谱柱内沉淀，不但影响纯化分离，而且会使色谱柱恶化。
6、样品易于回收：应选用挥发性溶剂。
二、流动相选择
高效液相色谱仪(HPLC)中，溶剂的洗脱能力与溶剂极性相关。
1、正相色谱的流动相：在正相色谱中，溶剂强度随极性的增强而增加。正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。
2、反相色谱的流动相：在反相色谱中，溶剂强度随极性的增强而减弱。反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂（如甲醇、yi腈和四氢fu喃等）。极性调整剂的性质及所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下，甲醇－水系统满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小，价格低，是反相色谱蕞常用的流动相。
乙腈－水系统与甲醇－水系统相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，可满足在紫外185～205nm处检测的要求，综合来看，乙腈－水系统优于甲醇－水系统。
在分离含极性差别较大的多组分样品时，为了使各组分均有合适的k值并分离良好，需采用梯度洗脱。
三、流动相脱气
1、流动相脱气的原因：高效液相色谱仪(HPLC)所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵工作、柱分离效率、检测器灵敏度和基线稳定性，甚至无法检测。
（1）流动相中的溶解氧可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。
（2）溶解氧会引起溶剂pH变化，给分析结果带来误差。
（3）溶解氧能与某些溶剂（如甲醇和四氢fu喃）形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以下），导致检测灵敏度轻微降低，更重要的是在梯度洗脱时会造成基线漂移或形成鬼峰。除去溶解氧将大大提高UVD的性能。
（4）在荧光检测中，溶解氧在一定条件下会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪quan和酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。除去溶解氧将改善在一些荧光检测中的灵敏度。
（5）在电化学检测中（特别是还原电化学法），溶解氧的影响更大。
2、常用脱气方法：有吹氦脱气法、加热回留法、超声波脱气法、抽真空脱气法和在线真空脱气法等。
四、流动相过滤
所有溶剂使用前都必须经0.45μm或0.22μm滤膜过滤，以除去杂质微粒。色谱纯试剂也不例外，除非在标签上标明已过滤。用滤膜过滤时，要注意分清有机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。
有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或过滤不动。水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂。否则滤膜会被溶解，溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC。对于混合流动相，可在混合前分别过滤。如需混合后过滤，有机相滤膜。现已有混合型滤膜。
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