逆转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3'-末端上，按5'→3'方向，合成一条与RNA模板互补的cDNA单链，它与RNA模板形成RNA-cDNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程：
1、逆转录病毒(属于RNA病毒):RNA→DNA→RNA
包括RNA肿瘤病毒科、慢病毒科和泡沫病毒科，广为人知的有人类免疫缺陷病毒(HIV)和人类嗜T细胞病毒(HTLV)以及劳氏肉瘤病毒(RV)等。此类病毒遗传物质为两条相同的线状正链RNA，自带逆转录酶和整合酶。病毒进入细胞后，以正链RNA为模板，逆转录合成双链DNA，双链DNA由整合酶整合至染色体DNA上形成前病毒。前病毒活化时，转录出作为病毒遗传物质的正链RNA和mRNA。
2、拟逆转录病毒(属于DNA病毒):DNA→RNA→DNA
包括嗜肝DNA病毒科和花椰菜花叶病病毒科，广为人知的乙肝病毒(HBV)即属于此类。此类病毒的遗传物质为一个双链的环状DNA，但该DNA的两条链长度不相等，通常负链完整、正链较负链短，导致该DNA上存在着一部分单链区，被称为rcDNA。病毒进入细胞后，rcDNA进入细胞核，由细胞的DNA聚合酶修补其单链部分、延长正链，从而形成完整的双链环状DNA，并形成螺旋结构，以独立于染色体之外的微型染色体的形式在细胞核内单独存在，即cccDNA(共价闭合环状DNA)。cccDNA转录出多种mRNA，其中一种mRNA包含了cccDNA的全部遗传信息，为前基因组RNA，是逆转录的模板。其合成的病毒DNA聚会酶具有逆转录酶功能，能以前基因组RNA为模板，逆转录合成病毒的遗传物质DNA。
