PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测方法

发布时间:2023-02-15

这是实验室*常用的方法,简便易行,只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时,由于泳动速度不同而被分离,经溴化乙锭(EB)染色,在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%,应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖,这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。


1、制胶


琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来,过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml,称取琼脂糖2g于三角瓶中,加入100ml 0.5×TBE液,微波炉加热2-5min,使琼脂糖完全溶解(注意不要暴沸),置室温等温度下降至60℃时,加入终浓度0.5μg/ml的EB液,充分混匀后倒板(注意排除气体)。


2、加样和电泳


上样时一般取PCR反应液5~10μl,加入3μl溴酚兰液,充分混匀,加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪,电泳工作液为0.5×TBE液,接通电源,使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约30-60分钟。


3、检测


将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测,DNA产物与荧光染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现,并与扩增时所设的阳性对照比较,判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照,判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。

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