一、细菌污染
状态:细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状,根据感染细菌的不同,可有不同的外形,培养液一般会浑浊变黄,对细胞生长影响明显。
预防和补救:
1.仔细检查一下器皿的灭菌情况,是否在高压灭菌时放气时间和压力足够!尤其是和储存培养液接触的移液管等物品,连续两次污染的话有可能造成储存液污染,一定要检查培养液是否存在浑浊现象!
2.可在培养液或血清中加支原体预防剂。
3.若细胞一旦污染,建议加支原体清除剂,能清楚常见的革兰氏阴性和阳性菌。
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二、霉菌及真菌污染
状态:肉眼观察培养基发现培养基颜色基本无变化,不浑浊,但是培养基中由絮状漂浮物,显微镜下观察,若感染真菌可看到分叉细丝状的结构(不同种类结构不同),若感染霉菌显微镜下可看到片状的结构,不透明,真菌及霉菌对影响细胞的生长影响不大。
预防和补救:
1.保证细胞房的干净整洁,干燥的环境(潮湿的环境利于霉菌及真菌的生长)。
2.控制外来人员进出实验室。
3.对实验室及培养箱进行消毒。
4.若细胞非常珍贵,且不易获得,可以对污染的细胞采取如下操作。
悬浮细胞:收集细胞并离心,用PBS漂洗,重复此操作数次。贴壁细胞:用PBS轻轻冲洗细胞,丢弃,重复此操作数次。
三、支原体感染
状态:镜下黑色,多为多形,培养液一般会浑浊,国内血清很多没做支原体阴性检测,而支原体是牛血清中*常见的微生物。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后,细胞病变不很明显,只是慢慢死亡。
预防和补救:
预防:实验室新购买的血清及培养基需检测是否含有支原体,引进的新品种细胞需做支原体检测,向培养基中添加预防支原体的抗生素。
补救:向培养基中添加抗生素,(如氧氟沙星10 μg/ml、环丙沙星10 μg/ml、卡那霉素20~50 μg/ml、四环素10~50 μg/ml、庆大霉素200μg/ml等抗生素),或者向培养基中添加支原体清除剂清除支原体数天。
四、黑蛟虫
状态:可以穿透滤膜,也可以通过空气传播,低倍下为黑色点状,高倍镜下可看见黑色的小虫游来游去,培养液不浑浊,一般不会太影响,细胞还可以用。常常可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。
预防和补救:一般黑胶虫不会影响细胞的生长状态,可以尝试改变培养基的。血清冻融采取逐级冻融的方法。
五、原虫感染
状态:培养液可轻微浑浊,显微镜下那些细小的点状物数量非常多,轻微活动,细胞虽然可用生长但繁殖速度却明显减慢,而且细胞状态不好,边缘不清楚,细胞不透亮。他们与细胞可共生,但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的,但他们的数量小,细胞占优势所以不会影响到细胞的正常生长,只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长,*终形成恶性循环。
除以上污染源外,配液消毒问题、操作问题也是污染原因。关于培养基的无菌状况,取培养基至培养瓶中(不加细胞),37度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长就是操作及细胞培养箱环境的问题。