共焦显微测量是一种很有前景的技术，具有非接触测量和高精度位移识别能力，广泛应用在芯片加工、高精密仪器制造、生物医学、材料化学、工业检测等领域。
其沿轴向位置高精度扫描的二维图像可用于三维重建，然而，扫描的速度限制了图像的采集速率，为了克服这一局限性，研究人员提出了许多方法对传统的共聚焦显微镜系统进行了改进。例如，基于扫描振镜光束扫描型共焦显微镜、基于数字微镜装置的共焦显微镜、差分式扫描共焦显微镜等。
上海理工大学的毛肖肖团队发表文章讨论了各种共聚焦显微镜的工作原理、物镜类型、扫描方法、优缺点及应用。随着光学核心部件的升级和各种准确、高效算法的出现，未来共焦显微镜的扫描速度会更快、应用范围更广、分辨率更高。
发展历程与工作原理
1955年，Marvin制造出了*台共聚焦显微镜，为这一技术的发展奠定了基础。1984年，Molesini等基于波长位移编码原理构建了表面轮廓仪，进一步推动了共焦技术的发展。此后，彩色共焦技术不断更新和扩展应用，众多科研人员在这一领域不断探索，使得共焦显微镜技术逐渐成熟。
1.激光共焦显微镜
激光共焦显微镜是在普通显微镜的基础上引入了“共焦技术”和 “激光扫描技术”。它以激光束为光源，激光通过照明针孔和准直透镜形成平行光，然后从分光镜反射到物镜并聚焦在样品上，在焦平面中对样品进行逐点X-Y轴扫描，探测器获得二维图像。由于光路中探测针孔和照明针孔存在共轭关系，只有聚焦在焦平面上的点才能在探测针孔处成像，焦平面外的点不会干扰成像。通过调整聚焦平面在Z轴上的位置，可获得一系列光学切片图像用于三维重建。
激光共焦显微镜示意图
2.彩色共焦显微镜
彩色共焦系统采用复色光源，探测器通过接收不同波长的光信号还原出被测表面的三维形貌。复色光进入系统后，因色散物镜的色散作用会聚焦在不同轴向位置，只有聚焦在焦平面上的光才能进入探测器，其余杂散光被针孔遮挡。通过改变焦平面位置，就能获取样品不同深度的表面信息。通常将共焦反射显微镜放置在焦平面处，利用三维位移控制器改变物体位置，用CCD采集一系列不同深度二维图像，*进行三维重建。
简化的彩色共焦显微镜模型
共焦显微系统的组成
1.色散物镜
色散物镜是共焦系统的核心部件，其设计方式主要有折射式和衍射式。
折射式色散物镜：光学系统设计成熟，加工简单，价格合理，便于色散，早期应用广泛。不同研究人员通过各种透镜组合设计，实现了不同的色散和测量效果。例如，在不同波长范围内实现了不同的色散值和轴向分辨率，以及不同的测量范围和精度。
衍射式色散物镜：其色散特性与传统折射光学器件相反，色散效果更明显。为提高系统性能，常将折射和衍射透镜组合使用。此外，菲涅尔透镜也具有优势，如更好的线性度、可折叠等，但在宽波段成像方面还需进一步探索。
色散物镜
2.光源
共焦显微镜的照明针孔和探测针孔具有共轭关系，这一特性实现了三维空间滤波，可获得高空间分辨率的光学切片。针孔直径对成像的亮度和分辨率有重要影响，需综合考虑信噪比和光通量。在不同样本的共焦成像光路系统中，还需考虑针孔尺寸的调节和光路对准问题。对于彩色共焦技术，光源的选择尤为重要，白光光源可能会有能量损失影响信噪比，而连续光谱光源虽能扩展量程但价格昂贵。
3.共焦针孔
共焦针孔的大小需谨慎选择。如果针孔尺寸过大，系统横向分辨率将与传统光学显微镜相同，轴向精度降低；尺寸过小则会影响光的通过，导致光强度损失，降低测量精度。为了实现针孔的快速、准确以及可重复定位，开发了如圆形针孔电动线性阵列等多种改变针孔尺寸的系统。
共焦成像扫描方法
1.基于扫描振镜光束扫描型共焦显微镜
该系统使用激光作为点光源，通过两个可控制转动角度的转向振镜，分别对样品进行X和Y方向的逐点扫描获取二维图像，*终实现三维重建。这种扫描方式避免了机械移动，提高了扫描速率，横向分辨率是普通显微镜的2倍。但逐点扫描方式降低了测量效率，且探测器接收到的反射信号微弱，需使用灵敏度高的光电倍增管。
2.旋转Nipkow圆盘扫描共焦
1884年德国科学家Nipkow等提出Nipkow转盘法，1960年被应用在共焦显微镜中。利用旋转Nipkow圆盘的扫描共焦是基于多光束扫描的方法，可以实时成像。光源发出的光穿过被测物体聚焦的共轭平面上的针孔，形成多个点光源照射在样品表面，反射光在CCD上成像，配合圆盘高速旋转实现快速二维成像。由区域检测器获取2D图像，能形成真实共焦图像，但转盘对针孔尺寸和位置要求严格，不能改变系统分辨率，且系统复杂昂贵。
3.基于微透镜阵列的共焦显微镜
基于微透镜阵列的显微成像可降低杂散光影响，提高三维图像重构分辨率，还能提高光能利用率、扩大视场。其原理是将针孔阵列放置在分束镜前，光源穿过针孔形成光源阵列照明物体表面，通过区域相机CCD捕捉反射的针孔图案来确定高度，进而重建3D表面。但存在相邻针孔串扰问题，随着针孔间距减小，信噪比和深度分辨率降低，也会限制3D成像的横向分辨率。
4.基于数字微镜装置的共焦显微镜
数字微镜装置（DMD）由微反射镜组成阵列，可覆盖具有数百万个单独控制像素的2D区域。将DMD用作光束调制器件，可获得可编程针孔阵列，替代分束镜。经过光束整型后的平行光通过DMD反射到色散透镜，*用CCD采集图像信息。DMD可调整采样点，控制扫描速率，但进行共焦测量时纵、横向分辨率会比使用微透镜阵列时下降。
5.差分式扫描共焦显微镜
20世纪90年代国外相关技术已成熟，其原理是从物体表面反射的光束被一分为二，分别聚焦到放置在焦前和焦后的两个探测器上，对接收的轴向强度响应曲线进行差分计算获取变化信息。这种方式通过检测光学焦点改进了信噪比和轴向分辨率，抑制了噪声，轴向分辨率双倍提高，且不需要横向扫描，可实现样品表面轮廓的高速测量。
6.基于扫描源的彩色共焦显微镜
该显微镜采用波长扫描激光器连续、重复地产生与宽带光源等效波长的光，经色散物镜聚焦在被测物体上，由光电探测器接收发射光。系统不再使用光谱仪接收反射光，而是根据时间尺度反复获得反射光的光谱信息，*终解码光谱信息获得物体表面信息。与常规CCM相比，可提高三维轮廓检测速率。
共焦成像显微镜中的各种扫描方法
共焦成像扫描方法
1.三维重建
在传统共焦显微镜中，通过计算轴向响应的峰值强度确定物体轴向位置，常用的标准峰值波长提取算法存在误差，研究人员提出了多种改进方法。在彩色共焦显微镜中，可将彩色相机替代光电探测器作为接收端，利用光学层析特性，通过记录不同深度截面图像重构物体完整图像，需将RGB颜色模型转换为合适模型并通过算法实现与波长的对应关系。
2.透明材料检测
彩色共焦显微镜可对光学透明、半透明或弱散射材料进行断层深度剖面、多层成像和缺陷检查及厚度测量，检测层间界面处反射光后可提供准确薄膜厚度信息，且不会损坏样品。但测量过程中会因材料色散出现信号混叠、串扰等情况，降低信噪比，影响测量精度。需要对材料色散的误差进行理论分析，建立补偿模型提高测量精度。
半（透明）材料检测
3.工业集成检测
在精密领域中，表面粗糙度是重要参数。彩色共焦法对被测物体表面的纹理、倾斜、颜色等外界因素不敏感，具有良好抗干扰性，精度高，易于集成，适合工业现场的表面粗糙度测量和在线检测。例如，基于CCM开发的集成在微加工机床上的扫描系统，可在有振动环境下实现高精度测量，还可实现加工-测量一体化功能。
工业集成检测应用
4.生物医学成像
共焦显微镜在组织和细胞水平上对癌症成像具有很大前景，荧光反射共焦显微镜是一种无创光学成像方法，可准确分辨组织并检查皮肤细节，已被证明能高灵敏度和特异性诊断皮肤癌。还可结合其他生物技术用于多种生物医学研究，如拍摄荧光图像、全景扫描组织、观察细胞代谢等。
共焦显微在细胞生物学的应用
5.其他应用
共焦显微镜的三维成像还应用于日常安全运输中的变形监测、金属厚度评估等领域。
共焦显微在其他领域的应用
结与展望
传统的共焦测量法曾受视野和实时测量局限，扫描速率和精度受限。随着计算机和激光技术的快速发展，以及对光源选型和色散透镜分辨能力的深入研究，出现了多点并行的扫描方式，提高了二维信息采集速度和三维成像速度。
彩色共焦法因省略轴向步骤等优势，逐渐成为多个领域不可或缺的工具。相信在未来，共焦显微镜的扫描速度会更快、应用范围更广、分辨率更高，为微观世界的探索提供更强大的支持。
声明：本文仅用作学术目的。文章来源于:毛肖肖, 赵斌, 董祥美, 高秀敏. 共焦显微镜技术及其应用[J]. 光学仪器, 2024, 46(1): 82. Xiaoxiao MAO, Bin ZHAO, Xiangmei DONG, Xiumin GAO. Confocal microscope technology and application[J]. Optical Instruments, 2024, 46(1): 82.
