高时空分辨可视化技术是脑科学研究的重要工具。荧光显微成像技术在特异性、多样性、图像对比度和时空分辨率等方面具有显著优势，但由于光在组织中的穿透深度有限，无创的荧光成像难以在活体水平获取深层脑区神经血管单元的高分辨结构和功能信息。
因此，在脑科学研究中，荧光内窥显微成像技术受到越来越多研究者的青睐。得益于相关科学技术的发展，内窥镜探头在保持高性能的同时，实现了小型化并提供了更大的灵活性，可以植入活体大脑的不同深度处，开展特定深层脑区的功能调控研究。
深圳大学物理与光电工程学林方睿团队发表综述文章，介绍了基于梯度折射率透镜和单根多模光纤这两种探头的植入式荧光内窥显微成像技术及其发展和迭代进程，概述了它们在高分辨活体脑成像研究中的应用，以及在临床神经外科手术中的初步探索性应用。*，展望了荧光内窥脑成像技术未来的发展前景。
研究背景
一、脑科学研究的重要性及相关计划
脑科学研究在前沿学科中占据关键地位，Science杂志与上海交通大学联合公布的125个*前沿科学问题中有16个与脑科学领域相关。欧盟、美国、日本和澳大利亚等陆续开启脑科学研究计划，“脑计划”于2016年全面布局，明确了“一体两翼”发展战略，北京和上海也相继成立脑科学与类脑研究中心，2021年“脑计划”正式启动。脑科学研究不仅有助于探索未知大脑机制，还能为脑疾病寻找*诊断方案和治疗策略。
二、大脑的工作原理及神经血管单元（NVU）的重要性
大脑通过神经元细胞间的生物电信号传导发挥调控功能，脑血管为神经元网络提供氧气和营养并清除代谢产物。NVU由神经元、血管、胶质细胞、血脑屏障和细胞外基质构成，会产生与大脑健康和疾病相关的各种功能反应，如调节血脑屏障通透性、血管生成、血流动力学反应、神经炎症和干细胞活性等。在活体水平获取NVU结构和功能信息对脑科学研究至关重要，需要高时空分辨可视化技术。
三、现有脑影像技术的不足与荧光显微成像技术的优势及局限
临床脑影像技术如计算机断层扫描成像、磁共振成像、正电子发射断层成像等，空间分辨率为微米至亚毫米量级且耗时较长，难以满足活体NVU成像需求。荧光显微成像技术在研究目标的特异性和多样性、图像对比度和时空分辨率等方面有显著优势，但由于光在组织中的穿透深度有限，无创荧光成像难以获取深层脑区NVU的高分辨结构和功能信息。近红外成像更适合活体应用，但传统荧光成像技术成像深度局限于脑表层至浅层海马区，无法覆盖深层脑区。因此，研究人员将目光转向内窥镜技术，期望通过植入微型探头的荧光内窥镜开展活体深层脑功能调控研究。
基于GRIN透镜的
植入式内窥活体脑成像
一、GRIN透镜的特性及在活体脑成像中的应用方式
GRIN透镜折射率沿径向渐变，使出射光线会聚成衍射极限光斑，具有直径小（通常小于1mm）、结构简单、装配方便、成本低和NA相对较大（不小于0.5）等优点。在活体脑成像中，常将其作为植入式内窥探头，与普通显微镜或微型显微镜配合，增加工作距离，实现对深层NVU的高时空分辨内窥成像。不过，成像时需吸除目标脑区上层组织，且可能造成出血和炎症反应，因此目前主要用于啮齿类动物模型研究，实验通常在植入3-4周后进行，以降低炎症影响并进行长期观测。
二、基于GRIN透镜的成像技术在脑科学研究中的具体应用
1、血流动力学与脑疾病研究
Jung等利用荧光素钠标记血浆，通过宽场显微成像记录小鼠和大鼠海马体单个红细胞在毛细血管中的流动，发现脑部微血管血流速度减慢与神经退行性疾病有关，为深层脑区血流动力学检测提供新方向。
Barretto等对原位胶质瘤小鼠模型进行长期荧光内窥成像，发现肿瘤生长时周围毛细血管直径扩大但血流速度降低，正常血管形态和锥体神经元结构稳定，这有助于理解脑胶质瘤微环境重塑，展示了长期荧光内窥技术在脑病模型研究中的价值。
2、神经元调控行为机制研究
用于研究眶额皮层神经元调控食物摄取行为、内侧杏仁核神经元调控社交行为以及前内侧丘脑神经元调控长期记忆等不同脑区神经元调控动物行为机制。
三、GRIN透镜成像技术的优化与发展
1、像差补偿方法
商用GRIN透镜存在像差，可通过多种方法校正。如增加平凸微透镜、黏合带有负球差的盖玻片或在盖玻片上3D打印非球面微透镜，也可采用自适应光学（AO）技术，如加州大学Ji教授团队将HiLo显微技术引入宽场内窥系统，利用AO校正模块补偿像差，提高了成像性能。
2、与双光子成像技术结合
双光子成像与GRIN透镜结合可实现高分辨率轴扫描，无需移动透镜，且飞秒脉冲光在GRIN透镜中色散小。Webb团队验证了其可行性，后续研究通过多种方法提高成像性能，如Moretti 等用SLM调制光场实现多焦点或图案照明，Meng等将高斯光束调制成贝塞尔光束提高体成像速度，香港科技大学瞿佳男教授团队提出AO校正策略提升纵向深度分辨率，并利用快速电调谐透镜实现多平面Ca2+信号同时成像。
3、微型显微镜的应用
微型显微镜质量轻，可在小动物自由活动时获取NVU成像数据。将GRIN透镜嵌入微型显微镜可实现内窥脑成像，如Flusberg等设计的微型双光子内窥显微镜可实现海马体以下约80μm的血管成像，Grewe等将GRIN透镜与微型显微镜结合长期观测神经元Ca2+响应，Barbera等在微型内窥显微镜中添加可变焦液体透镜研究不同深度神经元信号传导。
4、多区域成像方法
为研究跨脑区神经元关联性，发展了多种低成本成像方法。如Yang等设计的MATRIEX技术，通过多个GRIN透镜实现不同脑区神经元集群功能成像；Pochechuev等和Toader等将光纤束与GRIN透镜装配进行内窥脑成像，研究不同脑区神经元集群关联性，揭示了长期记忆巩固受丘脑-皮层回路调控等机制。
基于单根多模光纤的
植入式内窥活体脑成像
一、多模光纤的特点及在活体内窥脑成像中的原理
多模光纤能传播多个光学模式，信息传输带宽大，直径极小（50-125μm），插入脑组织时对周边神经元伤害小，可实现极微创内窥脑成像。但不同光学模式在光纤中传输时存在模式色散、干涉和耦合，形成光学散斑，限制了其在高分辨率图像传输和活体成像中的应用。基于多模光纤的高分辨率内窥成像通过传输矩阵测量和波前整形实现，利用光学调制器件调控光纤输出光场，传输矩阵控制入射波前实现光斑扫描，成像系统还包括光场调制、荧光成像、相机和参考光校正模块。
二、多模光纤成像技术的发展历程及性能提升措施
1、早期研究与思路验证
多模光纤成像方法虽早有报道，但早期受光纤加工工艺和工作环境影响，成像质量不佳。2010年Popoff等的研究为高分辨成像提供思路，后续Bianchi等、Cizmar等不断改进，提高了成像速度和分辨率。
2、抗干扰与校准方法
为克服外界干扰，提出多种方法，如引入虚拟信标、在光纤远端加工部分反射器、表面结构或引导星，以及利用深度学算法实现动态校准，如卷积神经网络（CNN）等模型的应用。
三、多模光纤成像技术在活体脑成像中的应用成果
1、SLM调制成像
2018年Vasquez-Lopez等采用SLM调制实现活体大鼠背侧纹状体脑区神经元三维成像，对脑组织损伤小，还可通过SLM随机扫描研究Ca2+信号动态监测，研究活体大鼠丘脑区接受声音刺激后的Ca2+响应。
2、DMD调制成像
DMD调制速率高，Turtaev等搭建的DMD多模光纤内窥成像系统实现了较高成像速度和分辨率，可对视觉皮层和海马体深层神经元进行动态成像；Shay等设计的双色成像系统可捕捉快速传导的Ca2+信号；Silveira等改进的侧视多模光纤实现了贯穿全脑的神经元功能成像，浙江大学刘旭教授团队的技术实现了传输矩阵实时校准，推动了多模光纤内窥成像技术的临床应用。
荧光内窥脑成像技术
在临床上的应用
一、在脑肿瘤术中诊断的具体应用及优势
活体荧光内窥脑成像技术在小动物模型中成果显著，在临床脑肿瘤术中实时诊断方面发挥重要作用。神经外科医生借助带有手持式探头的内窥镜显微镜和荧光示踪剂（如荧光素、吲哚菁绿和5-氨基乙酰丙酸等），可在微观尺度上检查脑组织中的肿瘤残余，改善手术治疗效果。如Charalampaki等展示了荧光内窥成像技术在脑膜瘤手术中的应用，Irakliy等搭建的术中远程病理学软件平台可实现高效术中决策。
二、荧光寿命显微成像（FLIM）在临床脑肿瘤手术中的探索性应用
FLIM利用组织荧光寿命差异提供高对比度图像，在临床脑肿瘤手术中有初步探索性应用，可辅助无标记识别肿瘤组织。加州大学Marcu教授团队将FLIM内窥系统与手术显微镜集成，通过监测荧光寿命辅助医生优化手术方案，实现大面积脑肿瘤组织术中筛查。
结与展望
植入式荧光内窥显微成像技术在脑科学研究中发挥重要作用，已实现深层脑区的在体显微成像。GRIN透镜是常用光学元件，具有多种优势，适用于活体深层神经元集群功能和血流动力学研究；单根多模光纤成像技术虽新，但在特定需求研究中具有优势。可研制模式更稳定、抗干扰能力强的多模光纤；采用精细3D打印技术在多模光纤端面上加工透镜组，优化成像分辨率、景深和视场；增加荧光偏振和荧光寿命成像模态，解析神经元生理信息。随着相关技术发展，荧光内窥脑成像技术将取得新突破，推动脑科学研究，助力疾病治疗与预防。
声明：本文仅用作学术目的。文章来源于：林方睿, 张晨爽, 连晓倩, 屈军乐. 植入式荧光内窥显微技术及其在活体脑成像中的应用（特邀）[J]. 激光, 2024, 51(1): 0107001. Fangrui Lin, Chenshuang Zhang, Xiaoqian Lian, Junle Qu. Implantable Fluorescence Endoscopic Microscopy and Its Application in In Vivo Brain Imaging (Invited)[J]. Chinese Journal of Lasers, 2024, 51(1): 0107001.
