小鼠5核苷酸酶ELISA试剂盒说明书

小鼠5核苷酸酶ELISA试剂盒

 

本试剂盒仅供研究使用。

检测范围： 96T

0pg/ml-160pg/ml

 

使用目的：

本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中5核苷酸酶含量。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠5核苷酸酶水平。用纯化的小鼠5核苷酸酶抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入5核苷酸酶，再与HRP标记的5核苷酸酶抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的5核苷酸酶呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠5核苷酸酶浓度。

试剂盒组成

 

1	30倍浓缩洗涤液	20ml×1瓶	7	终止液	6ml×1瓶
2	酶标试剂	6ml×1瓶	8	标准品（160pg/ml）	0.5ml×1瓶
3	酶标包被板	12孔×8条	9	标准品稀释液	1.5ml×1瓶
4	样品稀释液	6ml×1瓶	10	说明书	1份
5	显色剂A液	6ml×1瓶	11	封板膜	2张
6	显色剂B液	6ml×1/瓶	12	密封袋	1个

标本要求

1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

3. 血清：

室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

4. 血浆：

应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 尿液：

用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

6. 细胞培养上清：

检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。

7. 培养细胞

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

8. 组织标本

切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

自备材料

1．蒸馏水。

2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。

3．振荡器及磁力搅拌器等

 

操作步骤

1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

2.

 

80pg/ml	5号标准品	150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液
4opg/ml	4号标准品	150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液
20pg/ml	3号标准品	150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液
10pg/ml	2号标准品	150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液
5pg/ml	1号标准品	150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

 

 

3. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

5. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

8. 温育：操作同3。

9. 洗涤：操作同5。

10. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

11. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

12. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。