快速提取全血RNA
北京雅安达生物技术有限公司
操作步骤：
次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量无水乙 醇!
使用前将10X红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1X.
操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%如1 ml RLT 中加入10μl β-巯基乙醇.此裂解液好现用现配.配好的RLT 4℃可放置一个月.
1. 在适合大小的RNase free离心管中加入1体积（<1.5 ml）加入各种抗凝剂新鲜血液 （颠倒混匀后）和3体积的红细胞裂解液RLB颠倒混匀可轻弹管壁确保混匀.
2. 室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）.
如果RNA降解严重可在冰上裂解但是时间可长一些以充分裂解.
3. 12000 rpm离心20秒倒弃红色上清并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团）留下完整的管底白细胞团.
离心后在管底应该见到白色的白细胞团也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起但是如果看到的是大部分的红色细胞团说明红细胞裂解很不充分应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤23.
上清尽可能的吸弃残留过多会稀释裂解液造成裂解结合异常产量纯度降低.
4. 涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬加入350μl（<0.5 ml全血）或者600μl（0.5-1.5ml全血）裂解液RLT吹打混匀后用手剧烈振荡20秒充分裂解.病人血样中白细胞数量可能大幅增加应该适当减少处理量.或者按照350μl（<2x106白细胞）或者600μl（2x106-1x107白细胞）比例加RTL.
5. 用带钝针头的一次性 1 ml（配0.9mm针头） 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满意匀浆结果（或者电动匀浆30秒）可以剪切DNA降低粘稠度和提高产量.
6. 较估计裂解物体积加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）此时可能出现沉淀但是不影响提取过程立即吹打混匀不要离心.
7. 立刻将混合物（每次小于700μl多可以分两次加入）加入一个吸附柱RA中（吸附柱放入收集管中）13000 rpm离心60秒弃掉废液.
8. 加700μl 去蛋白液RW1室温放置30秒12000rpm 离心30秒弃掉废液.
如果DNA残留明显可在加入RW1后室温放置5分钟再离心.
9. 加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!）12000 rpm 离心30秒弃掉废液.加入500μl漂洗液RW重复一遍.
10. 将吸附柱RA放回空收集管中13000 rpm离心2分钟尽量除去漂洗液 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应.
11. 取出吸附柱RA放入一个RNase free离心管中根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-80℃水浴中加热效果更好） 室温放置1分钟12000 rpm 离心1分钟.
12. 如果提取全血>0.5 ml或者>2x106白细胞加30-50μl RNase free water重复步骤11合并两次洗脱液或者使用次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍（如果需要RNA浓度高）.
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%但是浓度要低用户根据需要选择.
