一、目的：
1．学维生素C定量测定的一般原理，掌握用2，6-二氯酚靛酚滴定量测定食物和生物体液中维生素C的基本操作技术。
2．概括了解维生素C的生理意义及其在新鲜水果和蔬菜中的含量。
二、原理：
维生素C是人类膳食中必需的维生素，如果缺乏维生素C，将导致坏血病发生。因此，维生素C又称为抗坏血酸，有防治坏血病的功效。抗坏血酸在自然界分布十分广泛，存在于新鲜水果和蔬菜中，尤其是柠檬果实和一些绿色植物（如青辣椒、菠菜等）中含量特别丰富。
抗坏血酸在机体同具有广泛的生理功能，已知体内许多重要物质的代谢反应都需要抗坏血酸的参与。它是脯氨酸羟基化酶的辅酶，故有增进胶原蛋白合成的作用。机体中许多含疏基的酶，需要依赖于作为还原剂的抗坏血酸的保护，使酶分子的疏基处于还原状态，从而维持其催化活性。由于抗坏血酸的氧化还原作用，它可促进免疫球蛋白的合成，增强机体的抵抗力。同时还能使氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽（简称GSH），而GSH可与重金属结合而排出体外，因此维生素C常用于重金属的解毒。此外，抗坏血酸尚有许多其他生理功能，但其作用机理还不十分清楚。
抗坏血酸是一种不饱和的多羟基内酯化合物，稍有酸味的糖类白色晶体，易溶于水，故属于水溶性维生素。在溶液中其分子内C2和C3之间的烯醇式羟基上的氢极易解离并释放出H+，而被氧化成脱氢抗坏血酸，氧化后仍具有维生素C的生理活性，但它易分解为二酮古洛糖酸，此化合物不再具有维生素C的生理活性。维生素C有很强的还原性，在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，易被氧化而破坏。还原型和氧化型抗坏血酸可以互相转变，在生物组织中自成一氧化还原系统。
一、目的：
1．学维生素C定量测定的一般原理，掌握用2，6-二氯酚靛酚滴定量测定食物和生物体液中维生素C的基本操作技术。
2．概括了解维生素C的生理意义及其在新鲜水果和蔬菜中的含量。
二、原理：
维生素C是人类膳食中必需的维生素，如果缺乏维生素C，将导致坏血病发生。因此，维生素C又称为抗坏血酸，有防治坏血病的功效。抗坏血酸在自然界分布十分广泛，存在于新鲜水果和蔬菜中，尤其是柠檬果实和一些绿色植物（如青辣椒、菠菜等）中含量特别丰富。
抗坏血酸在机体同具有广泛的生理功能，已知体内许多重要物质的代谢反应都需要抗坏血酸的参与。它是脯氨酸羟基化酶的辅酶，故有增进胶原蛋白合成的作用。机体中许多含疏基的酶，需要依赖于作为还原剂的抗坏血酸的保护，使酶分子的疏基处于还原状态，从而维持其催化活性。由于抗坏血酸的氧化还原作用，它可促进免疫球蛋白的合成，增强机体的抵抗力。同时还能使氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽（简称GSH），而GSH可与重金属结合而排出体外，因此维生素C常用于重金属的解毒。此外，抗坏血酸尚有许多其他生理功能，但其作用机理还不十分清楚。
抗坏血酸是一种不饱和的多羟基内酯化合物，稍有酸味的糖类白色晶体，易溶于水，故属于水溶性维生素。在溶液中其分子内C2和C3之间的烯醇式羟基上的氢极易解离并释放出H+，而被氧化成脱氢抗坏血酸，氧化后仍具有维生素C的生理活性，但它易分解为二酮古洛糖酸，此化合物不再具有维生素C的生理活性。维生素C有很强的还原性，在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，易被氧化而破坏。还原型和氧化型抗坏血酸可以互相转变，在生物组织中自成一氧化还原系统。
食物和生物材料中常含有其他还原物质，其中有些还原物质可使2，6-DCIP还原脱色。为了消除这些还原物质对定量测定的干扰，可用抗坏血酸氧化酶处理，破坏样品中还原型抗坏血酸后，再用2，6-DCIP滴定样品中其他还原物质。然后从滴定未经酶处理样品时
2，6-DCIP标准溶液的消耗量中，减去滴定非抗坏血酸还原物质2，6-DCIP标准溶液的消耗量，即为滴定抗坏血酸实际所消耗的2，6-DCIP标准溶液的体积，由此可以计算出样品中抗坏血酸的含量。另外，还可利用抗坏血酸和其他还原物质与2，6-DCIP反应速度的差别，并通过控制样品溶液在PH1—3范围内，进行快速滴定，可以消除或减少其他还原物质的作用，一般在这样的条件下，干扰物质与2，6-DCIP的反应是很慢的或受到抑制。
生物体液（如血液、尿等）中的抗坏血酸的测定比较困难，因为这些样品中抗坏血酸的含量很低，并且存在许多还原物质的干扰，同时还必须预行脱蛋白处理。在生物体液中含有巯其、亚硫酸盐及硫代硫酸盐等物质，它们都能与DCIP反应，但反应速度比抗坏血酸慢得多。样品中巯基物质对定量测定的干扰，通常可以藉加入对-氯汞苯甲酸（简称PCMB）而得到消除。
本实验采用2，6-二氯酚靛酚滴定法，以新鲜水果、蔬菜和生物体液为分析材料，进行抗坏血酸含量测定。
三、器材及试剂
1．器材：
①松针、新鲜蔬菜（辣椒、青菜、西红柿等）、新鲜水果（桔子、柑子、橙、柚等）
②吸管 ⑥台天平 ③容量瓶 ④锥形瓶 ⑤微量滴定管
⑦组织捣碎机。 ⑧抽滤装置
2．试剂：
①2%草酸溶液：草酸2g，溶于100ml蒸馏水。
（2%草酸液可用4%偏磷酸—醋酸溶液代替）
②1%草酸溶酸：溶1g草酸于100ml蒸馏水。
③标准抗坏血酸溶酸：准确称取50.0mg纯抗坏血酸，溶于1%草酸溶液，并稀至500ml。贮棕色瓶、冷藏，好临用时配制。
④1%HCl溶液。
⑤0.1%2，6-二氯酚靛酚溶液：溶250mg2，6-二氯酚靛酚于150ml含有52mgNaHCO3热水中，冷却后加水稀释至250ml，滤去不溶物，贮棕色瓶内，冷藏（4℃约可保存一至三周）。每次临用时稀释10倍，并以标准抗坏血酸溶液。
⑥对-氯汞苯甲酸（简称PCMB）溶液（2mg·ml-1）称取100mgPCMB溶于50ml0.05mol·L-1 NaOH溶液中，过滤后滤液保存备用。（分析尿液样品用）
⑦抗坏血酸氧化酶（-20℃保存）
⑧水果汁（桔子汁、柠檬汁、番茄汁等）
⑨新鲜水果（桔柑类、橙、柚、柠檬、草莓、山楂、番茄等）
⑩新鲜蔬菜（辣椒、菠菜、青菜等）
11松针
12生物体液（血清、血浆等）
四、操作步骤：
1．不同样品用不同方法提取后滴定
（1）水果汁样品
将果汁充分摇匀后，取5ml样品放入50ml容量瓶中，用2%草酸溶液（或4%偏磷酸-醋酸）溶液稀释，并定容至50ml，混匀后通过快速滤纸过滤（或离心）。取滤液10ml放入锥形瓶内，立即用已过的2，6-DCIP溶液快速滴定至样品液呈现玫瑰色，并保持15—20s不变即为终点，记录所消耗的2，6-DCIP溶液的体积(ml)。样品液中抗坏血酸含量宜在0.1—0.2mg·ml-1范围内，如果偏高或偏低则可酌情增减样品用量或进行适当稀释。另取10ml蒸馏水作空白对照滴定。样品液和空白对照均至少各做3份，滴定结果取平均值，随时分别做好数据记录。
检测果汁（或其他样品）中干扰物质的存在，可取5ml新鲜果汁放入50ml容量瓶中，加少许抗坏血酸氧化酶晶体，轻轻混匀，放置10min，藉以破坏还原型抗坏血酸。然后再中入2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液释稀至刻度，混匀后过滤，取这种滤液10ml用
2，6-DCIP进行滴定，记下消耗的DCIP溶液体积（ml）。
（2）水果样品
将新鲜水果去皮，可食部分切成小块，称取25—50g样品置于匀浆器中或研钵内，加入25ml2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液研磨，抽提液倾入100ml容量瓶中，残渣再加25ml2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液研磨和抽提两次，每次抽提液均倾入容量瓶中，后用2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液定容至100ml。混匀后用快速滤纸过滤（初数ml滤液弃去）或离心，取滤液或上清液10ml放入50ml锥形瓶内，随即用2，6-DCIP溶液快速滴定至终点，取10ml2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液作空白对照滴定，样品液和空白对照的各平行做3份。
（3）蔬菜样品
称取新鲜蔬菜100—200g，洗净后淋干并用纱布拭去其表面水份，切成碎块置于组织捣碎器内，加入100ml2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液，捣碎1—2min。称取匀将20—50g倾入100ml容量瓶中，用2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液洗涤匀浆容器数次，洗液均转入容量瓶中，后稀释至刻度。混匀后用快速滤纸过滤（或离心），弃去初滤出的滤液。如果样品颜色颜色太深，可采用白陶土进行脱色处理。吸取滤液5—10ml放入锥形瓶中，立即用过的2，6—DCIP深液进行快速滴定。同时用2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液作空白对照，分别记下各次滴定所消耗的染料溶液的体积（ml）。
（4）松针样品
称取松针1g用水洗净，淋干并用滤纸吸去表面水分，放在研钵中，加入适量1%HCl溶液，充分研磨，静置后将上层抽提液倾入100ml容量瓶中。如此反复研磨抽提2—3次，后用1%HCl溶液稀释定容至刻度。混匀后过滤或离心，取滤液5ml放入锥形瓶中，随即用2，6-DCIP溶液滴定。另取5ml1%HCl溶液作出空白对照滴定。
（5）生物体液样品
生物体液中维生素C的含量测定应采用新鲜样品，分析前必须制备成无蛋白质样品。向离心管中先加入4ml血清（血浆、尿液等），再加入6ml2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液，充分混匀，离心（3500rpm）10min。取上清液8—9ml放入锥形瓶内，可直接用2，6-DCIP标准溶液进行滴定。样品和空白对照至少平行各做3份，取其平均值。
尿液样品在滴定前还必须用PCMB处理，即取9ml无蛋白上清液放入离心管中，再加1mlPCMB溶液（2mg·ml-1），混匀后放置5—10min。然后离心10min，取上清液8—9ml放入锥形瓶内，用2，4-DCIP溶液滴定之。
注意：各样品滴定过程宜迅速，一般不过2分钟。滴定所用的染料不应少于1ml或多于4ml，如果样品含抗坏血酸太高或太低时，可酌量增减样液。
2．2，6-二氯酚靛酚溶液的
准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0ml（含0.1mg抗坏血酸）置100ml锥形瓶中，加9ml1%草酸，用微量滴定管以稀释10倍的2，6-二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持15秒钟不褪色即为终点。由所用染料的体积计算出1ml染料相当于mg抗坏血酸。
五、结果与讨论：
1．计算：
VA为滴定样品时所消耗的染料ml数（平均值）；VB为滴定空白时所消耗染料的ml数。
2．讨论：
本法测定VC的利与弊。
注：①2%草酸可抑制抗坏血酸氧化酶，1%草酸因浓度低不能完成上述作用。偏磷酸有同样功效。若样品中含有大量Fe2+可用8%醋酸溶液提取，如仍用偏磷酸或草酸为提取剂，Fe2+可以还原二氯酚靛酚，如用醋酸则Fe2+不会很快与染料起作用。故可用4%偏磷酸-醋酸液代替2%草酸液。
②如浆状物泡沫很多，可加数滴辛醇或丁醇。
③若浆状物不易过滤，可离心取上清液测定。
④如滤液颜色太深，滴定时不易辨别终点，可先用白陶土脱色。
⑤样品中某些杂质亦能还原二氯酚靛酚，但速度均较抗坏血酸慢，故终点以淡红色存在15秒钟为准。
