加州大学戴维斯分校研发*激光显微镜

 

 

 

在神经科学研究中，深入了解大脑的活动机制一直是科学家们的追求目标。传统的双光子显微镜在成像时存在一些局限性，例如采样速度、空间分辨率和视场之间的权衡，以及单光束扫描策略导致的成像通量限制和盲扫描策略带来的低效和热损伤问题。

 

为了解决这些问题，研究团队一直在探索新的自适应采样策略。

 

近日，加州大学戴维斯分校的研究团队研发出一种*的双光子荧光显微镜，为高速大脑成像带来了新的突破。

 

 

原理与特点

 

研究团队的显微镜使用了自适应线激发的采样方案，其工作原理是用动态图案匹配神经元细胞体局部结构的短线照射脑组织。通过数字微镜设备（DMD）对激发线进行空间调制，使其只捕获图像平面中的感兴趣区域（ROI，即神经元细胞体）而非背景区域。

 

DMD在这个过程中起到了关键作用，它作为强度调制器，加载与神经元细胞体形态匹配的二进制掩模，位于样本平面的共轭平面。飞秒激光（920nm）先被整形为线，通过谐振扫描仪（8kHz）和振镜扫描到DMD上，DMD反射的光携带ROI的相关信息，通过中继系统、管透镜和物镜光学中继到样本平面以成像脑组织。

 

具有自适应线激发的双光子扫描显微镜的原理、光学装置和点扩散函数（PSF）

 

这种自适应线激发方案具有多个显著特点。首先，它单次测量采样区域更大，减少了成像中的行数，从而提高了帧率。例如，在实验中，他们将激发线的长度在样本平面上塑造为约11.5μm（1/e²），与小鼠大脑中神经元细胞体的直径相似（10-15μm）。这样既能保证快速成像速度，又能保持细胞分辨率，避免相邻神经元之间的过度信号串扰。

 

同时，该方法还对图像进行了有效的预处理，将盲采样方法记录的图像中的像素进行凝聚，大多属于单个源，减少了数据量和后续数据处理（分割和提取时间活动轨迹）的计算时间。

 

其次，该方案能*采样神经元细胞体，避免背景区域的不必要激发，从而大大降低了输送到脑组织的激光功率和热损伤。尽管激发线薄（2.0μm，半高全宽，FWHM），轴向PSF的FWHM约为16.5μm，但在保持细胞分辨率的同时有效地避免了相邻神经元之间的过度信号串扰。

 

实验设置和结果

 

为了验证该方案的有效性，研究团队进行了一系列实验。在模拟实验中，研究团队在模拟钙成像数据集中模拟了自适应线激发采样过程。结果表明，CalmAn（一种约束非负矩阵分解算法）*分割了神经元的空间足迹，提取的时间轨迹与地面实况具有高皮尔逊相关系数，神经元信号通常可以从空间重叠的神经元中分离出来。这说明自适应线采样记录保留了与原始高分辨率记录相同的信息，且计算资源需求显著降低。

 

钙成像中自适应线激发采样的模拟

 

在验证实验中，通过荧光幻影样本验证了DMD的光束图案能力和自适应采样的概念。实验结果表明，图像记录与二进制掩模匹配良好，验证了DMD与样本平面的共轭关系以及与样本结构的良好对齐，进一步验证了DMD与样本结构之间强大的映射关系。

 

通过幻影样本验证自适应采样方案

 

在活体实验中，研究团队在活体清醒小鼠中进行实验，小鼠初级视觉皮层（V1）的2/3层转染了钙指示剂GCaMP6f。

 

实验结果显示，采样策略减少了谐振扫描仪扫描的行数，从而将帧率提高到198Hz（FOV为500μm×695μm），显著高于传统双光子显微镜；使用自适应采样策略时，激光功率显著降低（比无自适应采样时小约14倍），平均激光功率仅为约1.5mW，避免了对小鼠大脑的热损伤；同时，*提取了单个ROI的时间活动轨迹，并在深度为450μm的皮层中*提取了91个ROI。

 

使用自适应线激发双光子显微镜对小鼠V1在150µm深度进行体内钙成像

 

此外，该方法还具有良好的兼容性和可扩展性。它与许多其他光束复用技术兼容，可进一步提高成像通量。通过适当设置和循环DMD模式，显微镜在不物理修改光学设置的情况下，保留了等效点扫描高分辨率成像的能力。

 

不过，当前的点扩散函数（PSF）可能导致成像神经元细胞体时出现离焦背景，未来可以通过进一步收紧光束的轴向范围或使用矩阵分解算法捕获细胞体附近的背景信号并将其去除来优化。

 

与其他类似线扫描策略相比，该方法避免了在成像深度、计算资源或系统设置方面的挑战。与SLAP2相比，有效插入损耗较低，可使用更常见和成本效益更高的80MHz飞秒激光。

 

结与展望

 

的来说，这种*的双光子显微镜具有硬件简单、不需要调制器和扫描仪同步等优势，同时通过结合光束复用技术和使用更快的谐振扫描仪，成像速度可达到千赫兹，适用于电压成像，也可用于三维/体积成像和成像具有更精细特征的ROI，如树突和棘突。

 

这项研究为神经科学研究提供了一种强大的工具，有助于我们更深入地了解大脑的活动机制。期待未来能有更多的研究成果基于此技术展开，为人类健康和科学发展带来更多的福祉。

 

 

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于:Yunyang Li,Shu Guo,Ben Mattison,Junjie Hu,Kwun Nok Mimi Man,and Weijian Yang, "High-speed two-photon microscopy with adaptive line-excitation,"Optica 11,1)