引物设计的原则：
1.引物长度：一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的*适温度。
2.引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要过70%或有连续8个互补碱基同源。
3.序列Tm值：引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不过2度。退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8)
4.G+C含量：有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物的3′端：引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰；引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高； 引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败
6.引物的5′端：引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、*、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
