毛细管电泳仪测定乳品中蛋白质:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />
孟 序 天津市乳品食品监测中心 300381
1 毛细管电泳仪是以毛细管为分离通道。以高压直流电场为驱动力的液相分离技术。
它发展于80年代中后期，是分析领域继高压液相色谱之后又一重大发展。长期以来该技术在医药方面应用广泛，可用于蛋白质分离、糖分析、DNA测序、手性药物分离、单细胞分析等方面。虽然人们可从多种驯养动物那里获得乳，但是牛乳仍然是液态奶和其他乳制品主要来源。鲜牛乳含有3.0％ - 3.5％ 蛋白质，其中60％ 的为酪蛋白(CN)，15％为乳清蛋白，剩余的多种小分子被统称为非蛋白质氮，酪蛋白微粒被称为胶束包括四种主要蛋白质：a51，a52，β，γ 酪蛋白，他们的比例接近于3.9：1：3.6：1.3；乳清蛋白是在牛乳清液中，此类蛋白质呈球状主要是β-乳球蛋白(0.32％牛乳)和a-乳球蛋白(0.12％牛乳)。绝大部分定性定量分析乳品中蛋白质的方法要求首先分离乳清蛋白和酪蛋白，而毛细管电泳例外，它可以提供一个快速，高分辨率，良好量化并适合于各种混有乳的产品分析方法。
2 试验设备及材料
2.1 毛细管电泳仪(美国贝克曼MDQ型)
2.2 涡旋混合器
2.3 高速离心机
2.4 涂层毛细管(聚丙烯酰胺和聚乙烯醇PVA，内径分别为50，75um)
2.5 PH计
2.6 药品(优级纯以上)：磷酸二氢钠磷酸氢二钠尿素二硫代苏糖醇羟丙基甲基纤维素磷酸
氢氧化钠柠檬酸三钠柠檬酸纯水等。
3 样品及电泳缓冲液制备
电泳缓冲液不仅影响管壁的状态，而且改变样品的性状，样品处理、电泳缓冲液和管壁涂层三者结合才能达到好分离效果。研究经验表明对于蛋白质、多肽、氨基酸等两性样品采用酸性(pH2)或碱性(PH>9)分离条件。
3.1 柠檬酸缓冲液制备：
配制32 mmol柠檬酸，20 mmol柠檬酸三钠，0.05％羟丙基甲基纤维素，6 mol尿素电泳缓冲液用pH计调节pH值3.0；配制40 mmol柠檬酸三钠0.1％二硫代苏糖醇6 mol尿素样品缓冲液用pH计调节pH值为8.0(调节pH值溶液为0.1 mol柠檬酸和0.1 mol氢氧化钠)。
3.2 磷酸盐缓冲液制备：
配制20 mmol磷酸二氢钠，0.05％羟丙基甲基纤维素，6 mol尿素电泳缓冲液用pH计调节pH值3.0；配制40 mmol磷酸氢二钠，0.1％二硫代苏糖醇6 mol尿素样品缓冲液用pH计调节pH值为8.0(调节pH值溶液为0.1 mol磷酸和0.1 mol氢氧化钠)。
3.3 样液制备：
液态牛乳样品按体积比1:4加入样品缓冲液，奶粉1:10蒸馏水稀释后按体积比1:4加样品缓冲液，在涡旋混合振荡器上混匀，静置0.5 h以上，高速离心机5 000r离心5-10 min，去除上层脂肪，0.22 um滤膜过滤，滤液备用。
4 电泳条件选择
蛋白质是由氨基酸通过酰胺键连接而成的高分子，分子量差别较大，氨基酸属两性分子，并有碱性、酸性、中性之分，对应的蛋白质也是两性物质。因为其折叠方式、空间结构和修饰基团的不同，还有亲水疏水之分。利用蛋白质的上述性质可选择毛细管区带电泳、等电聚焦电泳、凝胶电泳、亲和电泳等多种方式。其中毛细管区带电泳分析乳品中蛋白质具有分析速度快、消耗低、结果准确的优点。
4.1 在蛋白质分析时先采用二级管阵列检测器(PDA)对所分离的蛋白质进行全波长扫描，从扫描图中可以看到酪蛋白、乳清蛋白在214 nm处都有明显吸收，所以一般选择它作为检测波长。当我们只检测一种蛋白质时也可根据PDA扫描结果采用200、230、254 nm检测波长。
4.2 蛋白质在毛细管中吸附，源于疏水作用、静电作用和其他多种两相分配机制。因此不能使用裸管分离，这会造成局部电压过高过仪器承受范围，对仪器产生冲击。一般测定蛋白质选择抗吸附涂层管例如：聚丙烯酰胺和聚乙烯醇涂层管。
4.3 毛细管长度、内径影响蛋白质出峰时间和分离效果，毛细管长度在:namespace prefix = st1 ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags" />
4.4 在实验过程中平衡电压选择非常重要，针对不同缓冲液离子强度和涂层管应选择合适电压。经过多次实验柠檬酸盐缓冲液聚丙烯酰胺管选择25 KV平衡电压；磷酸盐缓冲液聚乙烯醇涂层管使用30KV比较合适。
4.5 进样时间压力控制样品量，样品量太少有一些含量少蛋白质峰面积很小定量不准，相反进样量过大会造成分离度不好峰拖尾。根据样品含乳量我们选择0.5 psi5 s和10 s两种进样方式。
4.6分离温度的选择主要取决于凝胶或筛分体系，如果使用聚丙烯酰胺和聚乙烯醇涂层管一般控制在25
5 结果及讨论
图一是聚丙烯酰胺管(
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