利用毛细管电泳仪测定B族维生素含量

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佳电泳条件的探讨

魏振承 张孝棋 张名位 孙 玲 池建伟 徐志宏 张雁

广东省农业科学农业生物技术研究所 广州 510640

摘要：探讨毛细管电泳对B族维生素的分离分析的佳电泳条件。结果表明：胶束电动力学毛细管色谱是分离分析B族维生素的一种有效的毛细管电泳操作模式；不同缓冲液及其pH对分离结果影响很大，100mmol/L硼酸钠缓冲液(pH8.5)比较适合B族维生索的分离分析；毛细管温度、运行电压对分离也有较大影响．在:namespace prefix = st1 ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags" />35cm× 50µm未涂渍石英毛细管条件下，采用pH8.5，附加50mmol/L SDS的100mmol／L硼酸钠缓冲液，毛细管温度20℃，运行电压5～8kv，能将水溶性维生素有效地分离。应用该电泳条件对“们泰其”麦绿宝进行维生素B₆、烟酸含量测定，结果表明该测定方法重复性较好，可用于维生素的定性定量分析。

关键词：毛细管电泳；胶束电动力学；毛细管色谱；维生素；测定

分类号：0657.8   文献标识码：A

维生素在人体新陈代谢中起着非常重要的作用。食品中维生素的含量是衡量其营养价值的一个重要指标．常规B族维生素测定方法需要进行复杂的样品前处理和化学反应，费时费力。为了更好地检测食品中B族维生索的含量，筛选出一种快速、简单的B族维生索测定方法就显得非常必要。

    毛细管电泳(HPCE)是8O年代后期在全世界范围内迅速发展起来的一种分离分析技术。毛细管电泳主要有4大特点：高效、快速、微量、自动化，只须通过改变操作模式和缓冲液的成分等因子，就可以获得很大的选择性，可以根据不同的分子性质(如大小、电荷数、疏水性等)对极广泛的对象进行有效的分离^[1] ．利用毛细管电泳进行维生素分离分析已有个别报道^[2] 。本文拟就毛细管电泳法进行B族维生素的分离分析的佳电泳条件作比较深入的探讨，为以后利用该技术进行食品的B族维生素测定打下基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

    实验在美国BioRad BioFocus 3000毛细管电泳分析仪上进行，毛细管35cm×50µm(购自河北永年光导纤维厂)，未涂渍柱。

1.2 试剂

    维生素B₁，B₆，烟酸，核黄素(维生素B₂)均为分析纯，用时配成一定浓度的混合液。硼酸，氢氧化钠，十二烷基硫酸钠(SDS)均为分析纯，所用水均为二次去离子水。

1.3 分离条件

    采用胶束电动力学毛细管色谱分离方法，缓冲液为不同pH，添加50mmol／L SDS的硼酸钠溶液．样品室温度2O℃，毛细管温度2O℃～30℃，3psi*sec压力进样，检测波长200nm，电极正到负，运行电压3～10kV。

1.4 毛细管电泳法测定B族维生素含量的重复性试验

    选用潮州市生物技术中心提供的“们泰其”麦绿宝进行毛细管电泳法测定维生素含量的重复性试验，具体方法如下：称“们泰其”麦绿宝10g．加入pH8.5的10 mmol／L硼酸钠200mL，提取1 h，过滤取滤液30mL，调pH至8.5，加SDS至终浓度为50 mmol／L，用pH8.5的l0mmol／L硼酸钠定容至50 mL，以此液作为测定液用二次去离子水配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL维生素B₆、烟酸标准液，在相同条件下对不同浓度溶液进行多次毛细管电泳，测量其峰面积，然后取其平均值，将峰面积对浓度作图，并计算出回归方程，依此对样品中的维生素含量进行定量测定。

2 结果与分析

2.1 缓冲液及其pH对B族维生素毛细管电泳分离的影响

实验采用20 mmol／L KH₂PO₄(pH分别为7.0，8.0，9.0．10.0)，SDS浓度为50 mmol／L，运行电压lO kV，毛细管温度2O℃，维生素分离效果不理想，而在其它条件相同的情况下，采用100mmol/L硼酸钠缓冲液(pH分别为7.0．8.0，8.5，9.0)则能实现维生素的良好分离。因此我们决定采用硼酸钠缓冲液对其它条件进行优化。实验表明：在其它条件相同的情况下，不同pH的硼酸钠缓冲液对不同维生素的出峰时间和出峰顺序有很大的影响，从而导致出峰顺序的改变（图1）。体来说，pH越高，出峰时间越滞后。在pH7.O时，出峰顺序为维生素B₆，烟酸，核黄素，维生素B₁．烟酸与核黄素没有很好分开；在pH8.0时，出峰顺序为维生素B₆，核黄素，烟酸，维生素B₁，这时核黄素比烟酸先出峰．核黄素与烟酸已经分开；在pH8.5时，出峰顺序与pH8.0时相同，此时核黄素与烟酸能分开得非常理想；当pH9.0时，出峰顺序仍为维生素B₆，核黄素，烟酸，维生素B1，但此时维生素B₆与核黄素已不能理想地分开。

2.2 毛细管温度对B族维生素分离的影响

以运行缓冲液为100 mmol/L硼酸钠，pH8.5，50 mmol/L SDS．运行电压5 kV，在不同的毛细营温度(20℃、25℃、30℃)下对分离的影响进行了试验。结果表明：温度越高，出峰越早，出峰时问间隔越小，但温度对出峰顺序没有影响。综合考虑上述结果，温度以20℃为宜，温度过高．会造成出峰时问间隔过小．但如果温度过低，SDS会析出。

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2.4 毛细管电泳测定B族维生素含量方法的重复性

采用pH8.5，添加50 mmol／L的SDS的100 mmol／L硼酸钠缓冲液，压力进样，毛细管温度20℃，运行电压8 kV，200 nm检测，对“们泰其”麦绿宝提取液进行毛细管电泳分析。根据麦绿宝测定液中维生素B₆、烟酸峰的峰面积和其标准溶液的回归方程可以计算出测定液中维生素的含量，从而得出样品中维生素B₆、烟酸的含量。8 次测定结果及其重复性分析见表1。从表1可以看出，应用毛细管电泳进行维生素含量测定的重复性较好，其变异系数均小于1.5％。