摘要 目的:建立姜及其不同炮制品的HPLC特征图谱分析方法指认其中主要成分并对生姜、干姜、炮姜、姜炭进行了化学成分的分析比较揭示姜的炮制原理。方法:采用HPLC法Alltech C18 (416 mm ×250 mm 5μm)分析型色谱柱检测波长280nm乙腈(A) - 水(B)梯度洗脱流速018 mL·min- 1 柱温30 ℃。对4个生姜样品、9个干姜样品、7个炮姜样品和9个姜炭样品的特征图谱进行比较采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A) ”软件进行分析。结果:所建立的HPLC特征图谱分析方法的重复性、精密度和稳定性良好。指认6 - 姜辣素、6 - 姜酚和姜酮3个色谱峰;从生姜到干姜、炮姜、姜炭的炮制过程中6 - 姜辣素逐渐降低 6 - 姜酚逐渐增高;姜酮在加工至炮姜时出现炮姜中含量高于姜炭而干姜和生姜中没有。结论:生姜随着加工炮制火候和条件的逐步剧烈所制成的干姜、炮姜、姜炭制品中的酚类成分在含量和成分间的比例上发生了变化。
关键词:高效液相色谱法;特征图谱;姜;炮制品
中图分类号: R917 文献标识码:A 文章编号: 0254 - 1793 (2009) 08 - 1248 - 05
Chem ical ingredients change of ginger processingwith HPLC spec if ic chromatogram3
WANGWei - hao1 L I Juan2 GAO Hui - min1 WANG Zhi - min13 3 ZHANG L i1(11 Institute of ChineseMateriaMedica China Academy of ChineseMedical SciencesBeijing 100700 China;21Postgraduate Student in Henan College of Traditional ChieseMedicine Zhengzhou450008 China)Abstract Objective: To establish an HPLC specific chromatogramanalyticalmethod and identify the main ingre2dients of fresh ginger and p rocessed p roducts dried roasted and charry ginger p repared from fresh ones in definite
drying or firing conditions. To elucidate the scientific evidence in the p rocessing of ginger. Methods:A HPLC analy2siswas carried out on an Alltech C18 column (416 mm ×250 mm 5μm)with the mobile phase consisting of aceto2nitrile (A) and water (B) in gradientmode11The detection wavelength was set at 280 nm and the column tempera2ture was kep t at 30 ℃. Four batches of fresh ginger eight batches of dried ginger seven batches of roasted ginger
and eight batches of charry gingerwere collected from Chinese markets and analyzed with the established method.The data were analyzed with“similarity evaluation system for chromatographic specific chromatogram of traditionalChinese medicine (Version 2004A) ”. Results: The method held a good rep roducibility p recision and stability.Three main peakswere designated as 6 - gingerol 6 - shaogol and zingiberone in the HPLC specific chromatogram.
The contents of 6 - gingerolwere gradually decreased in the p reparation of dried ginger from fresh and roasted gin2ger from dried ones while 6 - shaogol were increased at same time. Zingiberone was emerged in the p reparation ofroasted ginger and then decreased in charry ginger by poignant firing. Conclusion: The contents and ratio of phenols
were changed in the p rocessed p roducts of ginger.Key words:HPLC; specific chromatogram; ginger; gingerps p rocessed p roducts
姜[ Z ing iber off icinale (W illd) Rosc. ]为姜科姜属植物生姜不同炮制加工条件制成干姜、炮姜和姜炭收载于2005年版药典一部中。生姜解表散寒温中止呕化痰止咳;干姜温中散寒回阳通脉
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“十五”科技攻关项目课题编号: 2001BA701A11 - 1燥湿消痰;炮姜温中散寒温经止血;姜炭长于止血温经温经作用弱于炮姜固涩止血作用强于炮姜。同一来源的药材经过炮制后形效各异的饮片那么其炮制过程伴随着什么样的化学变化呢? 为了阐述该变化前人的研究多集中于挥发油的GC -MS分析和比较上[ 1 2 ] 较少系统地研究炮制过程对其主要化学成分的影响。为此本文从不同产地姜炮制品(生姜→干姜→炮姜→姜炭)的特征图谱和主要化学成分分析的角度阐述炮制过程的化学变化。
1 仪器、样品与试剂
HP 1100 高效液相色谱仪 G1315A DAD 检测器 G1311A 四元泵 G1313A 自动进样器 G1316A柱温箱G1322A在线脱气机Agilent Chemstation 色谱工作站; KQ - 100E型超声波清洗器。生姜:河南生姜购于信阳市产地河南信阳;四川生姜购于四川成都;安徽生姜购于河南郑州产地安徽;山东生姜购于北京产地山东。干姜、炮姜、姜炭各样品均购于各地药店。药材经中医科学中药研究所何希荣老师鉴定。对照品:均为自制。6 - 姜辣素、6 - 姜酚由生姜药材运用多种色谱技术制备得到。姜酮经化学全合成制备得到。上述3个化合物运用EI - MS、1H- NMR、13 C - NMR光谱技术经结构解析确定了化学结构。6 - 姜辣素、6 - 姜酚、姜酮分别以HPLC- PDA检测面积归一化法进行计算纯度分别为97% 95% 。乙腈:色谱纯( FisherUSA) ;高纯水:本所自制;其他试剂均为分析纯。
2 色谱条件Alltech C18色谱柱( 416 mm ×250 mm 5 μm) ;检测波长: 280 nm;流动相:乙腈(A) - 水(B) 洗脱梯度[ 15% A ( 0 min) →35% A ( 15 min) →70% A(40 min) →85% A ( 60 min) → A ( 85 min保持5 min) ]; 流速: 018 mL ·min- 1 ; 进样量10 μL。理论塔板数按6 - 姜辣素计应不低于3000。
3 供试品溶液的制备311 生姜供试品溶液 将生姜切成碎末取10 g
精密称定置50 mL 磨口三角瓶中精密加入甲醇10 mL称重超声(功率250 W频率50 kHz) 30min 放冷至室温称重用甲醇补重摇匀吸取部分液体过0145μm滤膜即得。
312 干姜、炮姜、姜炭的供试品溶液 将干姜、炮姜、姜炭粉碎过20目筛取1 g按“311”项下方法自“精密称定??”起开始操作即得。
4 精密度、重复性、稳定性试验取同一供试品溶液在“2”项条件下连续进样5次记录色谱图考察精密度。另取同批药材6份精密称定按“3”项下方法制备供试品溶液进行分析记录色谱图考察重复性;将供试品溶液分别在0 10 20 30 40 60 h进样分析记录色谱图考察供试品溶液的稳定性。将所得数据采用药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统( 2004A) ”软件进行处理生成上述3个验证试验各自的对照特征图谱各组测定数据分别与软件数据处理系统生成的相应的对照特征图谱进行比较结果表明:精密度、重复性、稳定性试验相似度分别大0199
0199 0198符合特征图谱测定的要求。
5 色谱峰的指认分别取对照品6 - 姜辣素、姜酮、6 - 姜酚适量用甲醇分别制备浓度为015 013 015 mg·mL - 1的单一成分溶液过0145 μm滤膜取续滤液即得3个对照品溶液。将供试品溶液与各对照品溶液以“2”项下的色谱条件进行分析按照同一化合物在相同的色谱条件下相同的保留时间处具有相同的紫外光谱图的原则指认了生姜、干姜、炮姜、姜炭中的姜酮、6 - 姜辣素、6 - 姜酚3个成分见图1。
6 特征图谱测定和相似度分析取生姜4 个样品、干姜9 个样品、炮姜7 个样品、姜炭9个样品按“3”项下方法制备供试品溶液在上述色谱条件下进行分析记录色谱图分析结果采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A) ”软件进行处理结果见表1～4。表1 生姜相似度计算结果
Tab 1 Results of sim ilar degree of fresh
g ingers from d ifferen t sources
样品源( samp le resource)
安徽(Anhui)
河南(Henan)
四川 Sichuan)
山东( Shandong)
安徽(Anhui) 11000 01977 01957 01975
河南(Henan) 01977 11000 01950 01979
四川( Sichuan) 01957 01950 11000 01922
山东( Shandong) 01975 01979 01922 11000
药物分析杂志Chin J Pharm Anal 2009 29 (8) — 1249 —
? 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 图1 各炮制品对照特性图谱
Fig 1 The reference specific chromatogram of fresh ginger and gingerps p rocessed p roducts
A. 6 - 姜辣素(6 - gingerol) B. 姜酮( zingiberone) C. 6 - 姜酚(6 - shaogol) D. 生姜( fresh ginger) E. 干姜( dried ginge) F. 炮姜( roastedginger) G. 姜炭( charry ginger)
61 6 - 姜酚(6 - shaogol) 101 6 - 姜辣素(6 - gingerol) 111姜酮( zingiberone)表2 干姜相似度计算结果Tab 2 Results of sim ilar degree of dr ied g ingers from d ifferen t sources
样品源( samp le resource)
甘肃(Gansu)
四川( Sichuan)
山东( Shandong)
云南(Yunnan)
浙江(Zhejiang)
上海( Shanghai)
广西(Guangxi)
河南(Henan)
同仁堂(Tongrentang)
甘肃(Gansu) 11000 01847 01779 01966 01985 01706 01652 01645 01610
四川( Sichuan) 01847 11000 01937 01891 01876 01627 01774 01765 01749
山东( Shandong) 01779 01937 11000 01841 01788 01598 01689 01683 01665
云南(Yunnan) 01966 01891 01841 11000 01956 01726 01670 01669 01646
浙江(Zhejiang) 01985 01876 01788 01956 11000 01702 01683 01673 01637
上海( Shanghai) 01706 01627 01598 01726 01702 11000 01867 01879 01861
广西(Guangxi) 01652 01774 01689 01670 01683 01867 11000 01997 01993
河南(Henan) 01645 01765 01683 01669 01673 01879 01997 11000 01995
同仁堂(Tongrentang) 01610 01749 01665 01646 01637 01861 01993 01995 11000
表3 炮姜饮片的相似度计算
Tab 3 Results of sim ilar degree of roa sted g ingers from d ifferen t sources
样品源( samp le resource)
安徽(Anhui)
成都(Chengdu)
广西(Guangxi)
河南(Henan)
临晰(L inxi)
南宁(Nanning)
松原( Songyuan)
安徽(Anhui) 11000 01628 01831 01961 01946 01569 01654
成都(Chengdu) 01628 11000 01524 01707 01612 01581 01655
广西(Guangxi) 01831 01524 11000 01826 01808 01460 01602
河南(Henan) 01961 01707 01826 11000 01945 01589 01704
临晰(L inxi) 01946 01612 01808 01945 11000 01636 01622
南宁(Nanning) 01569 01581 01460 01589 01636 11000 01816
松原( Songyuan) 01654 01655 01602 01704 01622 01816 11000
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? 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 表4 姜炭饮片的相似度计算
Tab 4 Results of sim ilar degree of charry g ingers from d ifferen t sources
样品源( samp le resource)
广西(Guangxi)
河南(Henan)
上海( Shanghai)
同仁堂(Tongrentang)
河南2(Henan 2)
南宁(Nanning)
四川( Sichuan)
云南(Yunnan)
扬州(Yangzhou)
广西(Guanxi) 11000 01761 01574 01458 01431 01623 01530 01421 01697
河南(Hwnan) 01761 11000 01440 01701 01815 01608 01527 01405 01860
上海( Shanghai) 01574 01440 11000 01367 01419 01742 01783 01698 01506
同仁堂(Tangrentang) 01458 01701 01367 11000 01792 01470 01469 01368 01656
河南2 (Henan 2) 01431 01815 01419 01792 11000 01459 01454 01466 01658
南宁(Nanning) 01623 01608 01742 01470 01459 11000 01947 01792 01830
四川( Sichuan) 01530 01527 01783 01469 01454 01947 11000 01784 01788
云南(Yunnan) 01421 01405 01698 01368 01466 01792 01784 11000 01535
扬州(Yangzhou) 01697 01860 01506 01656 01658 01830 01788 01535 11000
以各炮制品数据经“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A) ”软件进行数据处理生成的色谱
特征图为对照图计算各样品图与对照图的相似度。结果表明: 4个产地生姜相似度很高( > 0192) 说明产地对生姜的化学组成影响不大; 9个产地干姜体相似度有一定差异(多数> 0176) 说明各地制备干姜的方法有一定的差异;炮姜和姜炭的相似度分别在01460～01961 和01367 ～01947 之间且多数的相似度在015以下说明其炮制火候和工艺条件差异较大。
以甘肃产干姜特征图作为对照时发现2003年购买的样品(甘肃、四川、山东、云南、浙江)间的相似度较好( 01779 ～01985) 而与2006 年新购样品(上海、广西、河南、同仁堂)间的相似度较差(01610～01706) ;以上海产干姜的特征图作为对照时 2006年新购样品间的相似度大于01810。说明贮藏时间会对干姜的成分产生影响。各炮制品的对照特征谱见图1。峰2为生姜的特有峰(经分离和光谱鉴定确认为色氨酸) ;峰3、峰8为干姜和生姜的差异成分但因含量甚微未能进行结构鉴定。峰9和姜酮为炮姜、姜炭区别于生姜、干姜的特有成分。姜酮作为炮姜、姜炭新出现的特征成分其含量在炮姜中明显增加在姜炭中随着火候的加剧其含量降低。除上述差异性成分外可以明显看出姜辣素从生姜到干姜、炮姜、姜炭相对含量逐渐降低而姜酚的相对含量逐渐增加。通过计算6 - 姜辣素与6 -姜酚峰面积比可知:生姜、干姜、炮姜、姜炭中6 - 姜辣素与6 - 姜酚峰面积比的平均值分别为5412 ( n =4) 417 ( n = 9) 119 ( n = 7) 218 ( n = 9)
7 讨论
711 色谱条件选择 为了尽可能多地展现姜的各类化学成分进而明确其在炮制过程中的变化试验曾分别以200 280 nm波长进行研究结果表明:检测波长为200 nm时基线漂移严重而280 nm处响应灵敏度高峰个数多基线平稳峰形对称故而试验终确定280 nm作为检测波长。通过比较甲醇- 水和乙腈- 水流动相系统的分离情况后者的色谱峰形尖锐基线平稳分离度较好选作试验用梯度系统。
712 样品处理方法的选择 由于姜辣素、姜酚等成分对热不稳定为了真实地反映姜炮制品固有成分上的差异试验采用室温超声提取。在提取溶剂选择时为了反映药材全成分的基本情况对同一份样品分别采用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇依次提取分别分析比较不同极性段中各炮制品间的成分差异;结果表明甲醇能够提取出囊括各极性段的成分满足我们观察姜炮制过程全成分化学变化的要求因此采取甲醇超声提取法。
713 储藏及加工的影响 从炮制品相似度分析:生姜主要成分的相似度较好。各产地干姜样品相似度
与生姜相比下降分析与当地的加工炮制方式及贮藏条件有关。各地炮姜、姜炭相似度低推测炮制工艺和条件存在较大的差异提示加强炮制规范化的必要性。
714 炮制过程中化学成分变化 从炮制品特征图谱分析生姜中的特有成分色氨酸(峰2)在其他炮制品中消失;姜辣素作为生姜的主要成分由于结构不稳定在干燥或加热过程中发生脱水而形成姜酚逐渐成为干姜的主要成分;干姜进一步在砂烫的条件下形成炮姜这时姜辣素发生麦氏重排裂解反应产生姜酮;在干姜制成姜炭的过程中随着炮制条件的加剧大部分的成分炭化或挥散。
715 小结 综上所述本研究建立了姜炮制品的液
药物分析杂志Chin J Pharm Anal 2009 29 (8) — 1251 —
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相特征图谱方法并运用于生姜、干姜、炮姜、姜炭炮制过程的成分分析中从中寻找各制品间的差异揭示了炮制对姜化学成分的影响。
参考文献
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