摘 要:运用化学计量学方法探索姜科植物温郁金不同药材的挥发油色谱指纹图谱中化学成分的异同。指纹图谱数据由高效液相色谱法获得 流动相为乙腈- 0120 %磷酸水溶液梯度洗脱 流速1. 0 mLPmin 柱温20 ℃ 光谱记录范围为200～340 nm。应用渐进子窗口比较法对中药温郁金、温莪术及片姜黄挥发油指纹图谱- 光谱数据进行比较分析。经比较 温郁金和温莪术的色谱指纹图谱中 至少分别有15 和6 种单独的化学成分存在 两者的共有的化学成分有18种; 温莪术与片姜黄的共有化学成分13 种 而单独存在的化学成分至少分别有4 和7 种。
关键词:渐进子窗口比较法; 温郁金; 挥发油; 指纹图谱
中图分类号:R917 ; O657. 7 文献标识码:A 文章编号:100020720 (2006) 020020
渐进子窗口比较法是在子窗口因子分析基础上发展起来的新的化学计量学方法[1 2 ] 已地用于中药羌活、茵陈等挥发油指纹图谱的二维数据解析[3 4 ] 。收载在药典一部中的温郁金、温莪术与片姜黄为姜科同一植物温郁金(Curcuma we2nyujin Y. H. Chen et C. Ling) 的不同部位及不同加工方法而成的三种中药 其性味归经和功能主治既相近又不同 它们的区分多年来一直受到中医药工作者的关注。揭示这3 种药物的内在化学成
分本质的差异 对相关的药学研究与临床使用有重要的意义。中药色谱指纹图谱是一项新的中药现代质量控制技术 指纹图谱技术可整体上反应内在成分的情况 有可能大化的获得药品质量的信息[5 ] 运用化学计量学方法解析色谱指纹图谱二维数据有助于完善和提升中药色谱指纹图谱的质控技术。本文应用渐进子窗口比较法对温郁金、温莪术和片姜黄挥发油指纹图谱的HPLC -DAD 二维数据进行比较分析 发现来源于植物块根温郁金的挥发油与来源于植物根茎温莪术的挥发油中共有的化学成分有18 种 两者单独的化学成分分别有15 种和6 种; 植物根茎因加工方法不同而成的温莪术与片姜黄挥发油中共有的化学成分有13 种 两者单独的化学成分分别有4 种和7种。实验结果可为进步确定3 种药材挥发油中的化学成分及进行相关的药学研究提供参考数据。
1 仪器、药品与试剂
HP1100 型高效液相色谱仪 包括Agilent1100四元泵 HP1100 二极管阵列检测器 HP 色谱化学工作站(美国安捷伦科技公司) ; 所用程序用MAT2LAB 语言编写;温郁金(温州市大生堂中药店) 温莪术(浙江瑞安天瑞药业有限公司提供) 片姜黄(北京兴中中药饮片厂) 。以上三种药材 按药典2005版一部相关项下鉴别为药典规定的温郁金、温莪术和片姜黄。
牛儿酮对照品(111665 - 200401) 莪术醇对照品(100185 - 200405) : 药品生物制品所; 乙腈、甲醇: 色谱纯; 无水硫酸钠、H3 PO4 为分析纯。
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X 收稿日期: 2006206230 ;修订日期: 2006209226
作者简介: 方洪壮(1956 - ) 男 教授
? 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
http://www.cnki.net2 实验部分
2. 1 样品制备
2. 1. 1 挥发油制备 取经粉碎过孔径为850 ±29μm药筛的温郁金、温莪术与片姜黄粗粉各100 g 分别置2000 mL 硬质圆底烧瓶中 加水800 mL 浸泡过夜 按药典挥发油测定法中的甲法[6 ] 水蒸汽蒸馏提取8 h。收集挥发油部分 加入无水硫酸钠脱水后 密封、暗处冷藏。
2. 1. 2 供试液制备 取温郁金、温莪术及片姜黄挥发油各20μL 分别置10 mL 容量瓶中 加入甲醇至刻度 摇匀。经0. 45μm 微孔滤膜过滤 制成温郁金、温莪术及片姜黄的供试液。取 牛儿酮对照品与莪术醇对照品各约10 mg 精密称定 分别置100 和50 mL 容量瓶中 加入甲醇至刻度 摇匀。经0. 45μm 微孔滤膜过滤 吸取滤液各1 mL分别置10 mL 容量瓶中 加入甲醇至刻度 配制成
牛儿酮对照品溶液和莪术醇对照品溶液。另取牛儿酮和莪术醇滤液各1 mL 置10 mL 容量瓶中 加入甲醇至刻度配制成对照品混合液。
2. 2 色谱条件与指纹图谱
2. 2. 1 色谱条件 色谱柱: Eclipse XDB - C18 柱(250 mm ×4. 0 mm i . d. 5μm) 保护柱: Zorbax SB- C18柱(12. 5 mm ×4. 6 mm i . d. 5μm) ; 流动相:乙腈(A) - 0120 %磷酸水溶液(B) 作梯度洗脱 0min 体积分数55 %A～45 %B 保持5 min ; 25 min 75 %A～25 %B 保持15 min ; 50 min 100 %A 保
持10 min。流速: 1. 0 mLPmin ; 柱温: 20 ℃; 检测波长: 210 nm 参比波长: 350 nm; 进样量20μL 。
2. 2. 2 指纹图谱 取 牛儿酮、莪术醇对照品溶液及对照品混合液与温莪术挥发油供试液 分别按2. 2. 1 项下的色谱条件进行检测。根据 牛儿酮、莪术醇对照品的色谱峰确定对照品混合液色谱中的 牛儿酮与莪术醇色谱峰 见图1a 。选取温莪术挥发油色谱中的 牛儿酮色谱峰为参照物峰 按药品管理局的中药注射剂色谱指纹图谱研究技术要求(暂行) 规定的检测方法与相关内容制备指纹图谱 结果见图1b。另取温郁金和片姜黄供试液按上述温莪术指纹图谱制备方法获取指纹图谱 分别见图2a 和2b。
2. 3 数据分析
在色谱仪上间隔2 nm 记录采集温莪术、温郁金及片姜黄3 种挥发油的200～340 nm 色谱光谱二维数据 并选取各色谱中与参照物峰峰面积比大于5 %的色谱峰作为比较分析的目标峰。图1 对照品混合液(a) 和温莪术(b) 色谱图
Fig. 1 Chromatograms of reference standard mixed solution
(a) and curcuma wenyujin rhizome (b)
1 - 牛儿酮; 2 - 莪术醇图2 温郁金与片姜黄的色谱图Fig. 2 Chromatograms of curcuma wenyujin root tuber (a)and wenyujin concise rhizome (b)将两相互比较的样品分别视为样品1 与样品
2 设A 为样品1 中某一目标色谱峰的数据矩阵矩阵的大小为M ×N 阶 行的方向表征了色谱的流出信息( M 个流出时间点) 列的方向表征了光谱信息( N 个吸收波长) ; 设B 为样品2 的指纹图谱某一窗口内的数据矩阵 其大小为w ×N 阶 N与A 的光谱波长数相同 w 为按设定的窗口尺寸的色谱流出时间点数。两样品的指纹图谱的比较分析过程如下:先按固定尺寸移动窗口渐进因子分析法绘制
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http://www.cnki.net目标色谱峰的秩图[7 ] 确定目标峰中包括的化学成分数k。然后 分别对A 与B 数据矩阵进行奇异值分解 选取A 及B 分解后载荷矩阵的w 列抽象光谱阵E 及D 组成新的ETD 矩阵; 对ETD 矩阵奇异值分解 提取ETD 分解后的k 个大特征值e 计算残差特征值矢量r1 = 1 - e 。随后 按1 个色谱时间点沿保留时间方向进行窗口移动 从样品2 指纹图谱数据中取w 行数据构成新的子矩阵B 同上述计算步骤计算新残差特征值矢量r2 。不断移动窗口 重复构造新的子矩阵B 并计算残差特征值直至色谱终点 以得到一系列的残差特征值矢量r1 r2 ? ri ? rn ( n = M - w + 1) 对样品2 的保留时间作图绘制残差特征值曲线图。后 根据残差特征值对保留时间曲线图判定样品2中有无样品1 的目标色谱峰中的化学成分。将两相互比较的样品对调 对样品2 的各目标色谱峰进行上述的渐进子窗口比较计算判定两样品有无共有的化学成分 从而完成色谱指纹图谱化学成分存在与否的判别。
3 结果与讨论
3. 1 温莪术与温郁金的比较对温莪术与温郁金色谱- 光谱数据交替进行比较计算分析 得到两色谱指纹图谱中各化学成分构成及所在的峰位结果如表1。由表1 可知 温莪术、温郁金中共有的化学成分数为18 种 至少有6 种化学成分存在于温莪术中 而在温郁金色谱指纹图谱中未发现 温郁金至少有15 种化学成分单独存在。色谱指纹图谱中温莪术24. 27 min 与温郁金24. 26 min 处的色谱峰为 牛儿酮色谱峰。温莪术18. 19 min 色谱峰为莪术醇色谱峰 而温郁金中未发现莪术醇。
3. 2 温莪术与片姜黄的比较由于片姜黄色谱中 牛儿酮色谱峰的峰强度相对较低 在与温莪术比较分析时 是以其色谱中15. 38 min 处的强峰作为参照峰来选取目标峰。对温莪术与片姜黄色谱- 光谱数据进行比较分析 得到两色谱指纹图谱中各化学成分所在的峰位结果如表2。由表2 可知 温莪术、片姜黄中共有的化学成分数为13 种 温莪术色谱指纹图谱中至少有4 种化学成分单独存在 片姜黄中至少有7 种单独的化学成分存在。色谱指纹图谱中温莪术在24. 28 min 处与片姜黄24. 25 min 处的色谱表1 温莪术与温郁金的化学成分保留时间Tab. 1 Retention time (min) of components in curcuma we2nyujin rhizome and curcuma wenyujin root tuber温莪术
目标
峰数
保留时间
tPmin
温郁金
目标
峰数
保留时间
tPmin
共有成分数
No 1 8. 73
9. 12 2 9. 03 1
1 9. 33 9. 35 2
10. 10 3 10. 10 3
2 11. 98 No
3 13. 31 13. 32 4
14. 65 4 14. 65 5
15. 19 5 15. 33 6
No 6 15. 62
No 7 16. 07
4 18. 19 No
No 8 18. 67
5 19. 25 19. 30 7
19. 54 9 19. 45 8
19. 82 10 19. 92 9
No 11 20. 53
6 21. 66 No
No 12 22. 35
No 13 22. 96
No 14 23. 64
7 24. 27 15 24. 26 10
No 16 25. 61
No 17 27. 19
8 27. 81 No
9 38. 11 No
10 38. 88 39. 10 11
No 18 47. 22
50. 00 19 49. 99 12
1 13
No 21 53. 38
12 53. 54 No
No 22 53. 64
4
8 15
54. 95 24 54. 99 16
55. 36 25 55. 36 17
No 26 55. 63
No 27 56. 10
56. 80 28 57. 12 18
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http://www.cnki.net表2 温莪术与片姜黄中化学成分的保留时间
Tab. 2 Retention time of components in curcuma wenyujin
rhizome and wenyujin concise rhizome
温莪术
目标
峰数
保留时间
tPmin
片姜黄
目标
峰数
保留时间
tPmin
共有成分数
1 9. 33 9. 26 1
10. 11 1 10. 11 2
2 11. 98 No
3 13. 31 2 13. 36 3
15. 19 3 15. 38 4
No 4 17. 00
No 5 17. 86
4 18. 19 18. 17 5
5 19. 25 19. 39 6
No 6 19. 46
19. 82 7 19. 97 7
6 21. 66 21. 62 8
No 8 22. 35
7 24. 28 9 24. 25 9
No 10 24. 95
8 27. 81 11 27. 80 10
No 12 32. 95
No 13 34. 06
9 38. 11 No
10 38. 88 No
1
12 53. 54 No
2
3
峰为 牛儿酮色谱峰。温莪术在18. 19 min 处的色谱峰为莪术醇 片姜黄色谱中也有莪术醇存在但其峰强度很低 其所在位置的中心为18. 17min。
3. 3 窗口尺寸与峰位由于两相互比较的色谱指纹图谱是经过色谱条件的优化建立起来的 色谱中各色谱峰重叠程度较低 通常情况下 每一保留时间点下重叠的色谱峰数不会过3 个 所以 窗口尺寸w 选为3。在残差特征值曲线图中 当在某一保留时间处 指纹图谱数据片断B 中含有与目标峰A 相同的化学成分 残差特征值的数值必将接近于零
即残差特征值曲线接近零的区域为共有成分的色谱流出区域。当共有成分数为1 时 选取区域中间值作为相同成分的峰位; 当共有成分数大于1 时根据色谱先流入先流出的原则先确定各成分的流出区域 再分别取区域的中间值作为各组分的峰位。
参考文献
[1 ] Xu C H Liang Y Z Gong F et al . Anal Chim Acta 2001 428 : 235
[2 ] Manne R Shen HL Liang Y Z. Chemom Intell Lab Syst 1999 45 : 171
[3 ] Guo F Q Liang YZ Xu CJ et al . J Chromatogr A 2003 1016 (1) : 99
[4 ] Guo F Q Liang YZ Xu CJ et al . J Pharm Biomed Anal 2004 35(3) : 469
[5 ] 王 旭 王国荣. 药品标准 2005 6(4) : 48
[6 ] 药典委员会. 人民药典(一部) . 北京: 化学工业出版社 2005 附录: 57
[7 ] Keller H R Massart D L. Anal Chim Acta 1991 246 :379Comparison analysis of volatile oil of curcuma wenyujin using evolving subwindow comparison method
FANG Hong2zhuang
3 1 ZOU Cun2cai1 2 ZONG Xi2ming1 and SHI Quan1 (1. Heilongjiang Province Key Laboratory
of Biological Medicine formulation College of Chemistry and Pharmacy Jiamusi University Jiamusi 154007 ; 2. Dep2artment of Pharmacy Wannan Medical College Wuhu 241001) Fenxi Shiyanshi 2007 26(3) : 6～10
Abstract : To find out the similarities and differences of chemical components ithechromatographic fingerprints of
volatile oil from different crude drug of wenyujin herbage family Zingiberaceae by chemomemethod. The chrom2
atographic fingerprint data were acquired by high performance liquid chromatography witacetonitrile - 2 ‰phosphoric
acid gradient elution mobile phase flow rate 1. 0 mLPmin column temperature of 20 ℃ and of recorded wavelength
range 200～340 nm. The chromatographic spectroscopic data of fingerprints of curcuma wenyujin root tuber curcuma
wenyujin rhizome and wenyujin concise rhizome were comparatively analyzed using evolving subwindow comparison
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http://www.cnki.netmethod. The comparison results showed that 15 and 6 chemical components present alone in chromatographic finger2
prints of curcuma wenyujin root tuber and curcuma wenyujin rhizome respectively while 18 common components are
present in both samples. Also 13 common components are both present in curcuma wenyujin rhizome and wenyujin
concise rhizome as well as at least 4 and 7 components is respectively present alone.
Keywords : Evolving subwindow comparison method ; Curcuma wenyujin ; Volatile oil ; Fingerprint
