摘要 目的:建立同时测定满山红药材中金丝桃苷、槲皮素、山柰酚和杜鹃素含量的高效液相色谱方法。方法:采用Agilent
Zorbax SB C18色谱柱(416 mm ×150 mm 5μm) ;流动相为甲醇(A) - 012%磷酸水溶液(B) 梯度洗脱( 0～20 min 35% A→
60% A; 20～40 min 60% A→70% A) 流速018 mL·min- 1 ;检测波长为360 nm (0～29 min测定金丝桃苷、槲皮素和山柰酚)
和299 nm (29～40 min测定杜鹃素) ;柱温25 ℃。结果:金丝桃苷、槲皮素、山柰酚和杜鹃素线性范围分别为6140～16010μg
·mL - 1 ( r = 019995) 3133～83133μg·mL - 1 ( r = 019993) 0180～2010μg·mL - 1 ( r = 019998) 2167～66167μg·mL - 1 ( r =
019996) ;金丝桃苷、槲皮素、山柰酚和杜鹃素回收率( n = 3)分别为9615% ～9912% (RSD为112% ～116% ) 9616% ～9819%
(RSD为019% ～218% ) 9614%～10117% (RSD为210%～219% ) 9519%～10014% (RSD为014%～212% ) 。结论:该方法
简便快速结果准确可靠可用于中药满山红的质量控制。
关键词:高效液相色谱法;满山红;金丝桃苷;槲皮素;山柰酚;杜鹃素
中图分类号: R917 文献标识码:A 文章编号: 0254 - 1793 (2010) 02 - 0279 - 03
HPLC simultaneous determ ination of four flavonoids
in Rhododendron dau ricum L.
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L IANG Tai - gangMEN Xu - peng ZHAO Cheng - xiaoBAN Shu - rongL IQing - shan
3 3
( School of Pharmaceutical Science ShanxiMedical University Taiyuan 030001 China)
Abstract Objective: To establish an HPLC method for simultaneous determination of hyperoside quercetin
kaempferol and farrerol in Rhododend ron dau ricum. Methods: The separation was performed on an Agilent Zorbax
SB C18 column (416 mm ×150 mm 5μm) by gradient elution (0 - 20 min 35% A→60% A; 20 - 40 min 60% A
→70% A) using methanol (A) and 012% phosphoric acid (B) as the mobile phase. The flow rate was 018 mL·
min- 1 ; The detection wavelength was 360 nm (0 - 29 min) for hyperoside quercetin kaempferol and 299 nm (29 -
40 min) for farrerol with column temperature at 25 ℃. Results: The linear ranges of hyperoside quercetin
kaempferol and farrerol was 6140 - 16010μg·mL - 1 ( r = 019995) 3133 - 83133μg·mL - 1 ( r = 019993) 0180
- 2010μg·mL - 1 ( r = 019998) and 2167 - 66167μg·mL - 1 ( r = 019996) respectively; The average recoveries
( n = 3) was 9615% - 9912% with RSD of 112% - 116% 9616% - 9819% with RSD of 019% - 218% 9614%
- 10117% with RSD of 210% - 219% 9519% - 10014% with RSD of 014% - 212% respectively. Conclusion:
The method is simp le accurate and can be used for quality control of Rhododendron dauricum.
Key words:HPLC; Rhododendron dauricum L. ; hyperoside; quercetin; kaempferol; farrerol
满山红为杜鹃花科植物兴安杜鹃Rhododendron
dauricum L. 的干燥叶[ 1 ] 具有止咳、祛痰之功效用
于治疗急、慢性支气管炎哮喘等病症其化学成分
主要有黄酮、萜类和挥发油等[ 2 ] 。本课题组前期药
理学研究表明[ 3 ] 满山红黄酮具有明显的抗炎、
止咳、祛痰等作用属于活性有效部位因而有必要
对黄酮类化合物进行质量控制。目前国内对满山红
的质量研究主要集中在对杜鹃素进行含量测
定[ 4 5 ] 尚未见到对多种黄酮化合物如金丝桃苷、槲
皮素、山柰酚和杜鹃素同时测定的相关报道。本文
采用高效液相色谱法对不同产地满山红中金丝桃
苷、槲皮素、山柰酚和杜鹃素进行了含量测定为全
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山西省科技攻关项目(NO. 2006031201 - 01) ;山西医科大学校青年基金资助项目(NO. 2006011)
通讯作者 Tel: (; E - mail: qingshanl@yahoo. com
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面控制其质量奠定基础。
1 仪器和试药
LC - 10ATvp液相色谱仪 SPD - 10Avp 检测器(日本SH IMADZU公司) ;UV - 260紫外可见分光光度计(日本SH IMADZU 公司) ; N2000 色谱工作站(浙江大学智达信息工程有限公司) 。金丝桃苷对照品(批号1521 -200202 ) 、槲皮素对照品(批号10081 - 9905 ) 、杜鹃素对照品(批号110850 -200604)均购自药品生物制品所山柰酚(纯度大于99% )对照品购自Sigma公司;甲醇为色谱纯;水为重蒸水;其余试剂均为分析纯;满山红药材采自黑龙江、吉林、辽宁等地经山西医科大学药学高建平教授鉴定为杜鹃花科植物兴安杜鹃Rhododendron dauricum L. 的干燥叶。
2 方法与结果
211 溶液的制备
21111 混合对照品储备液 精密称取对照品金丝桃苷、槲皮素、山柰酚和杜鹃素适量加甲醇配制成浓度分别为320 68 40 133μg·mL - 1的混合溶液即得。21112 供试品溶液 精密称取干燥至恒重的满山红粉末(60目)约1 g于具塞锥形瓶中精密加入甲醇25 mL称重冷浸1 h后超声( 150 W 40 kHz)提取40 min放冷补足失重摇匀 0145μm微孔滤膜滤过取续滤液即得。212 色谱条件 色谱柱:Agilent Zorbax SB C18色谱柱(416 mm ×150 mm 5 μm) ;流动相:甲醇(A) -012%磷酸水溶液(B) 梯度洗脱(0～20 min 35%A→60% A; 20 ～40 min 60% A →70% A) 流速018 mL·min- 1 ;检测波长: 360 nm (0～29 min测定金丝桃苷、槲皮素和山柰酚) 和299 nm ( 29 ～40min测定杜鹃素) ;柱温: 25 ℃;进样量: 20 μL。对照品及样品色谱图见图1。
213 线性关系考察 精密量取混合对照品储备液012 014 1 2 3 4 5 mL分别置10 mL量瓶中加甲醇- 水(80∶20)定容摇匀配制成系列浓度混合对照品溶液。按上述色谱条件分别进样20μL记录色谱峰面积以峰面( Y)为纵坐标浓度X (μg·mL - 1 )为横坐标进行线性回归得金丝桃苷、槲皮素、山柰酚和杜鹃素的标准曲线回归方程分别为:
Y = 4179 ×103 X - 2125 ×103 r = 019995
Y = 1102 ×103 X - 1176 ×103 r = 019993
Y = 9196 ×102 X + 1168 ×102 r = 019998
Y = 1155 ×103 X - 2127 ×103 r = 019996
图1 对照品(A)及黑龙江齐齐哈尔产样品(B)色谱图Fig 1 Chromatograms of chemical referencesubstances (A) and sam2p le from Qiqihaer Heilongjiang(B)
1. 金丝桃苷( hyperoside ) 2. 槲皮素( quercetin ) 3. 山柰酚( kaempferol) 4. 杜鹃素( farrerol)金丝桃苷在614～16010μg·mL - 1 槲皮素在3133～83133 μg ·mL - 1 山柰酚在0180 ～2010 μg ·mL - 1 杜鹃素在2167～66167μg·mL - 1范围内线性关系良好。
214 精密度试验 取混合对照品溶液按上述色谱条件连续进样6次记录色谱峰面积计算金丝桃苷、槲皮素、山柰酚和杜鹃素峰面积的RSD分别为111% 018% 116% 112%。
215 重复性试验 精密称取同一批黑龙江齐齐哈尔产满山红样品粉末6份各约110 g照“21112”项下方法制备供试品溶液测定金丝桃苷、槲皮素、山柰酚和杜鹃素的含量计算各组分含量平均值分别为01220% 01051% 01030% 01096%; RSD 分别为117% 213% 118% 216%。216 稳定性试验 取供试品溶液分别于配制后0 2 4 8 12 24 48 h进样20μL记录峰面积结果金丝桃苷、槲皮素、山柰酚和杜鹃素峰面积的RSD分别为116% 111% 118% 213% 表明供试品溶液在48 h内稳定。217 加样回收率试验 精密称取已测知含量的黑龙江齐齐哈尔产满山红样品粉末9份每份约015g分别精密加入金丝桃苷对照品储备液3 mL、槲皮素对照品储备液4 mL、山柰酚和杜鹃素对照品储备液5 mL按“21112”项下方法操作制备所需溶液进样测定并计算加样回收率结果见表1。— 280 — 药物分析杂志Chin J Pharm Anal 2010 30 (2)
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表1 回收率测定结果( n = 3)
Tab 1 Recovery of HPLC a ssay
组分
( component)
加入量
( added amount)
/mg
平均回收率
( average recovery)
/%
RSD
/%
金丝桃苷( hyperoside) 01960 9615 112
1128 9912 114
1160 9712 116
槲皮素( quercetin) 01204 9816 216
01272 9619 019
0
山柰酚( kaempferol) 01120 10117 216
01160 9614 210
01200 9811 219
杜鹃素( farrerol) 02
0
0
218 样品含量测定 取不同产地满山红样品按“21112”项下方法制备供试品溶液。精密吸取对照品混合液(金丝桃苷、槲皮素、山柰酚和杜鹃素浓度分别为6410 7μg·mL - 1 )和供试品溶液各20μL注入液相色谱仪照上述色谱条件分析测定外标法计算满山红中各组分的含量结果见表2。
表2 样品含量测定结果( % n = 3)
Tab 2 Results of determ ina tion of samples
样品
( samp le)
金丝桃苷
(hyperoside)
槲皮素
( quercetin)
山柰酚
(kaempferol)
杜鹃素
(farrerol)
黑龙江齐齐哈尔(Qiqihaer
Heilongjiang)
01220 01051 01030 01096
黑龙江佳木斯(J iamusi
Heilongjiang)
01267 01068 01034 01108
黑龙江哈尔滨(Haerbin
Heilongjiang)
01204 01040 01028 01089
辽宁沈阳(ShenyangLiaoning) 01213 01064 01022 01076
辽宁抚顺(FushunLiaoning) 01284 01073 01036 01117
吉林长春(Changchun J ilin) 01191 01049 01020 01083
吉林松原(Songyuan J ilin) 01236 01072 01029 01114
吉林四平(Siping J ilin) 01215 01063 01039 01091
3 讨论
311 供试品溶液制备方法的确定 本实验考察了不同浓度甲醇、乙醇等溶剂的提取效率同时比较了不同的提取方法(超声、回流) 并对提取时间及提取溶剂的量进行了优化结果发现采用25 mL甲醇超声提取40 min效果好。
313 检测波长的选择 由于金丝桃苷、槲皮素和山柰酚在360 nm附近有大吸收而杜鹃素的大吸收波长位于299 nm在上述色谱条件下金丝桃苷、槲皮素和山柰酚的保留时间在29 min之前杜鹃素的保留时间在29 min之后为提高方法灵敏度、减少干扰本实验设定程序变化检测波长0 ～29 min为360 nm 29～40 min为299 nm。
314 流动相的选择 曾尝试采用甲醇- 水、甲醇-醋酸水溶液、乙腈- 醋酸水溶液等体系进行等度洗脱但均难以达到4种组分在短时间内完全分离而选用甲醇- 012%磷酸水溶液进行线性梯度洗脱可使4种成分在较短的时间内完全分离满足测定需要。
315 小结 本实验建立了同时测定满山红中4种黄酮类成分含量的方法为系统评价满山红的质量提供理论依据。由测定结果可知各产地满山红样品中金丝桃苷与杜鹃素的含量较高而山柰酚的含量相对较低。
参考文献
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