摘要:针对虎杖乙醚组分复杂体系的分离借助于CSASS软件选用相同的起始体积分数〔φ(甲醇) = 10% 〕、不
同的强溶剂浓度梯度、终达到相同体积分数〔φ(甲醇) = 〕的5次简单的线性梯度快速获取了虎杖乙醚
组分中44个峰的保留值方程。同时利用色谱峰自动曲线拟合方法获取了各色谱峰的峰形参数用分离峰的峰
形参数σ、W1 /2与t
3
R 线性回归获取了峰形规律并且用于对谱图的仿真。在此基础上应用移动重叠分辨分离图
和谱图仿真技术发展了计算机辅助的虎杖乙醚组分的高效液相色谱全局优化方法。在优化条件下虎杖乙醚
组分的HPLC分析可在60 min内完成当中的常量成分都能够得到较好的分离度。
关键词: CSASS;高效液相色谱;优化;虎杖;中药现代化
中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号: 1003 - 5214 (2007) 08 - 0761 - 05
Optim iza tion of High Performance L iqu id Chroma tographicMethod for
Ana lysis of Extract of Polygonum cuspida tum
ZHANG Cai2ning1 WANG Xu2man1 XUE Xing2ya2 XIAO Hong2bin2 L IANG Xin2miao23
(1. Tex tile and M aterial College X i′an Poly technic University X i′an 710048 Shaanxi China; 2. Dalian Institute of
Chem ical Physics The Chinese Academ y of Sciences Dalian 116023 L iaoning China)
Abstract: For the separation of comp lex system of ether fraction of P. cuspidatum CSASS software was
used. The LC retention value equation of ether fraction of P. cuspidatum was obtained correctly and
quickly by using five linear gradients in which CB was started with 10% and ended with in
different time intervals. Based on the technology of automatic curve fitted the peak shape parameters
and peak shape law in ether fraction of P. cuspidatum were obtained. By using moved overlapp ing
separation rangingmap (OSRM) and simulated chromatograms technology the LC op timization method
was developed.
Key words: CSASS software; high performance liquid chromatography ( HPLC ) ; op timize; P.
cuspidatum;modernization of Chinese medicine
Founda tion item s: National natural science foundation of China (NO. 20235020 ) ; major frontier
p rojects of Chinese Academy of Sciences (KGGX2 - SW - 213)
中药虎杖为蓼科蓼属多年生草本植物虎杖
( Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. )的根及根茎主要分布于江苏、广东、四川等省区。虎杖味苦、性寒具有祛风利湿、散癖定痛、止咳化痰等功效[ 1 2 ] 。3 收稿日期: 2006 - 12 - 04;定用日期: 2007 - 03 - 15基金项目:自然科学基金重点项目(No. 20235020) ;科学知识创新工程重要方向项目(KGGX2 - SW -213)
作者简介:张彩宁(1977 - ) 女博士电话: E - mail:
zcn1977@163. com。
联系人:梁鑫淼男研究员博士生导师电话: E - mail: liangxm @dicp. ac. cn。
编者注:作者曾以此文在2006年12月9～10日于广州华南理工大学召开的科学技术协会青年科学家论坛第122次会议(主题:中
药现代化与系统生物学)上交流受到热烈欢迎。
? 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
http://www.cnki.net虎杖中主要含有蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类、萘醌类等化学成分其中蒽醌类化合物是其主要的活性成分包括大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、大黄酚等具有消炎、抗菌、止泻、利尿及抗肿瘤、抗病毒等作用同时也是大黄、何乌、决明子等中药材的活性成分[ 3～8 ] 。目前用于分析蒽醌类成分含量的方法有很多 主要包括分光光度法、薄层色谱法(TLC) 、高效液相色谱法(HPLC)和毛细管电泳法HPCE) [ 9 10 ] 。高效液相色谱法由于其分离效率高重现性好结果准确性高在分析虎杖以及其他中药化学成分的过程中得到了广泛应用[ 11 ] 。由于药材虎杖提取物成分复杂各成分含量差别比较大而且性质多样要建立一个稳定的具有普遍应用价值的分析方法采用线性梯度实验来获
取色谱保留参数进而优化操作条件是一个佳的选择。本文借助于科学大连化学物理研究所编制能快速解决复杂未知样品辅助定性、拟合定量、分析条件优化的复杂样品分析软件系统———CSASS(Comp lex Samp le Analysis Software System) [ 12 ] 根据
虎杖中各组分在5次线性梯度下的保留时间利用组分的保留因子与其保留参数a、c的关系lnk = a +ccB (其中k是保留因子 cB 是流动相中强溶剂的浓度) 快速准确地计算各组分的液相色谱保留参数a、c值以及峰形参数σ(代表峰宽)和τ(代表峰的拖尾程度) 。在此基础上应用移动重叠分辨图和谱图仿真技术发展了计算机辅助的虎杖乙醚组分的液相色谱全局优化方法为虎杖药材的质量控制、指纹图谱的研究工作提供了可借鉴的分析手段及优化方法。
1 实验部分
111 仪器和试剂 全自动液相色谱仪 PDA
996 二极管阵列检测器 Millennium 32 工作站 ;大连依利特C18色谱柱( 250 mm ×
416 mm i. d. ; 10μm) (日本富士) 。高效液相分析用甲醇和甲酸均为CG分别购于天津科密欧化学试剂开发中心和美国Alfa Aesar公司;水为Mili2Q二次水。
112 样品的制备称取中药虎杖V (乙醇) ∶V (H2O) = 70∶30提取
物14 g混悬于300 mL乙醚中用150 mL水萃取收集乙醚层。下层的水相再连续用50 mL的乙醚萃取3 次合并乙醚层得虎杖乙醚组分。取少量抽干用甲醇溶解色谱分析前过0145μm滤膜。4 ℃保存。
113 色谱条件色谱柱温度恒定为35 ℃。流动相为甲醇(A) /水(B)系统两相均含有体积分数为011%的甲酸;流速为1 mL /min。进样量10μL。在梯度条件(见表1)下获取虎杖乙醚组分在5次线性梯度下的色谱图。
表1 分析色谱柱C18上的梯度条件
Table 1 Gradient condition on C18 column
Samp le Grad name Gradient condition
Ether faction of
P. cuspidatum
G01
G02
G03
G04
G05
φ(A) = 10% (1 min) →49 min→φ(A) = (10 min)
φ(A) = 10% (1 min) →59 min→φ(A) = (10 min)
φ(A) = 10% (1 min) →69 min→φ(A) = (10 min)
φ(A) = 10% (1 min) →79 min→φ(A) = (10 min)
φ(A) = 10% (1 min) →89 min→φ(A) = (10 min)
114 数据处理
用CSASS软件进行数据处理其中包括谱图拟合子系统( CSA ) 、保留数据计算子系统( HPLC2AC) 、保留时间预测子系统(HPLC2Pre) 、校正因子系统(Calibrate) 、移动重叠分辨分离图绘制的台阶梯度条件选择子系统(Op timize)以及谱图动态仿真优化子系统(CSA) 。
2 结果与讨论
211 色谱保留参数的获取本文选用相同的起始体积分数〔φ (A ) =10% 〕、不同的强溶剂浓度梯度、终达到相同体积分数〔φ(A) = 〕的梯度模式作为预实验的条件。通过对5次线性梯度模式下的实验谱图进行拟合得到44 个色谱峰的实验保留时间信息采用CSA软件计算获得其a、c参数列于表2中。表2 虎杖乙醚组分各成分的保留参数Table 2 Retention parameters of components in ether fraction of
P. cuspidatum
id a c id a c
1 1. 74 - 17.
2 2. 93 - . 36
3 8. 07 - 30. 20 25 14. 39 - 26. 13
4 6. 49 - 19. 54 26 10. 31 - 17. 38
5 6. 24 - . 83
6 11. 91 - 33. 09 28 15. 83 - 26. 31
7 8. 23 - 29
8 8. 77 - 22. 67 30 9. 33 - 14. 64
9 8. 78 - 22. 20 31 8. 17 - 11. 80
·762· 精细化工 F INE CHEM ICA L S 第24卷
? 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
http://www.cnki.net续表2
id a c id a c
10 7. 26 - . 31
11 6. 05 - . 30
12 6. 86 - . 85
8. 99 - 11. 56
12. 87 - 16. 60
7 11. 92 - 14. 59
5. 17 - 4. 95
9. 80 - 11. 34
11. 77 - 13. 72
19 11. 27 - 22. 48 41 10. 78 - 12. 27
20 8. 35 - 1
21 7. 84 - 14. 80 43 11. 63 - 12. 56
22 8. 28 - 14. 95 44 10. 91 - 11. 54
212 虎杖乙醚组分的峰形参数及规律通过5 次简单线性梯度求得a、c值后通过
CSA软件读入5次线性梯度下的色谱图可以得到各峰的虚拟保留时间t3R 和σ、τ、W1 /2等峰形参数值。由于τ的精度对谱图仿真影响不大且全谱图色谱峰的峰形估测主要由σ和W1 /2完成因此本文只考察了参数σ和W1 /2与t3R 的关系来获取峰形规律。表3 列出了虎杖乙醚组分中8 个基线分离峰
(峰1、2、4、5、12、31、35、44)在5 个线性梯度下的
σ、W1 /2参数与相应的t
3
R 。线性回归后得到如图1所
示的σ、W1 /2与t
3
R 的线性关系图。从图中可以看出 R2 分别为01723 3和01733 7表明σ和W1 /2与t3R 有较好的线性关系。后得到峰形规律如公式
(1)和(2)所示这就为谱图仿真打下了基础。表3 线性梯度下各分离峰的峰形参数以及虚拟保留时间
Table 3 Shape of parameters and t
3
R under linear gradient conditions
id
G01
σ W1 /2 t
3
R
G02
σ W1 /2 t
3
R
G03
σ W1 /2 t
3
R
G04
σ W1 /2 t
3
R
G05
σ W1 /2 t
3
R
5. 02 11. 87 6. 30 5. 20 12. 29 6. 41 5. 36 12. 64 6. 53 5. 27 12. 43 6. 59
2 5. 85 13. 79 7. 38 6. 45 15. 21 7. 96 7. 23 17. 04 8. 48 7. 61 17. 95 9. 0
4 5. 61 13. 23 6. 47 6. 34 14. 96 6. 99 6. 97 16. 43 7. 52 7. 66 18. 05 8. 0
5 6. 05 14. 26 6. 82 6. 74 15. 89 7. 41 7. 22 17. 02 8. 02 7. 97 18. 78 8. 72 8. 63 20. 32 9. 32
12 5. 52 13. 01 7. 27 6. 10 14. 38 7. 96 6. 73 15. 88 8. 69 7. 30 17. 19 9. 46 7. 88 18. 56 10. 16
31 6. 33 14. 93 8. 29 6. 73 16. 27 9. 21 7. 68 18. 09 10. 15 8. 43 19. 88 11. 12 9. 41 22. 19 12. 03
35 6. 25 15. 64 8. 39 7. 30 17. 65 9. 32 8. 06 19. 86 10. 27 8. 67 21. 91 11. 28 9. 57 24. 17 12. 22
44 5. 26 12. 40 8. 41 5. 99 14. 12 9. 32 6. 66 15. 68 10. 28 7. 88 18. 58 11. 28 8. 46 19. 93 12. 25
图1 虎杖乙醚组分t
3
R -σ( a) t
3
R - W1 /2 ( b)关系
Fig. 1 σ vs t
3
R ( a) andW1 /2 vs. t
3
R ( b) of ether fraction of P. cuspidatum
σ = 11565 + 01617 × t
3
R (R2 = 017233) (1)
W1 /2 = 310199 + 115474 × t
3
R (R2 = 017337) (2)
213 任意梯度条件下的谱图仿真根据虎杖乙醚组分44个峰的a、c值(见表2)以及由8 个基线分离峰获得的峰形规律(公式1
2) 用CSA软件仿真可以得到任意梯度条件下的仿真谱图。图2a和2b分别显示了G02条件下的实验谱图和仿真谱图。经过比较发现仿真谱图和实验谱图非常相似二者的保留时间及峰形几乎一致。这一结果证明利用5次线性梯度获取的虎杖乙醚组分中44个成分的色谱保留参数a、c值以及由8个基线分离峰的峰形参数线性回归后得到的峰形规律是准确的可用于谱图仿真进行优化以及建立活的色谱指纹谱。
第8期张彩宁等:虎杖提取物高效液相色谱分析方法的优化·763·
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http://www.cnki.neta—实验谱图; b—仿真谱图
图2 任意梯度条件G02下虎杖乙醚组分的实验( a)和仿真( b)谱图(254 nm)
Fig. 2 Experimental ( a) and simulate ( b) chromatograms for ether fraction of P. cuspidatum under condition G02 (254 nm)
214 虎杖乙醚组分的全局优化由虎杖乙醚组分44个成分的热力学规律借助于移动重叠分辨分离图技术可得到虎杖乙醚组分44个峰的全局优化浓度台阶梯度。人工干预后的多阶梯度分离条件如表4所示(流动相为甲醇/水系统两相均含有体积分数为011%的甲酸) 。根据表4的条件以CSA软件进行谱图动态仿真后得到的全局优化仿真谱图如图3 所示。从图3 可以看出虎杖乙醚组分当中的常量成分都能够得到比较好的分离度分离的时间也比较满意(60 min) 。表4 人工干预后得到的流动相梯度条件
Table 4 Gradient conditions aftermanual intervention
Step Num 011%formyl2
methanol
011% formyl2
H2O
t /
min
Flow/
(mL /min)
Type of
gradient
1 35 65 10 1
2 43 57 12 1 linear
3 43 57 22 1 isocratic
4 50 50 24 1 linear
5 50 50 34 1 isocratic
6 100 0 54 1 linear
7 100 0 60 1 isocratic
图3 优化条件下虎杖乙醚组分的仿真谱图
Fig. 3 Stimulated chromatogram for ether fraction of P. cuspidatum under op timal condition
·764· 精细化工 F INE CHEM ICA L S 第24卷
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http://www.cnki.net3 结论
(1)利用5次线性梯度快速准确地获取了虎杖乙醚组分44个峰的色谱保留值方程为目标优化提供了基本的数据信息。
(2)利用色谱峰自动曲线拟合方法获取了虎杖乙醚组分的峰形参数。用分离峰的峰形参数获取了峰形规律并且用于对谱图的仿真。经过比较发现仿真谱图和实验谱图非常一致。
(3)根据虎杖乙醚组分的液相色谱保留值方程和峰形规律应用移动重叠分辨图和谱图仿真技术发展了计算机辅助的虎杖乙醚组分的液相色谱全局优化方法为虎杖液相色谱活指纹谱的应用研究奠定了理论和方法基础。
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从图1可以看出氨基的两个N—H键不等但X射线衍射分析只给出一个N—H键的值。这说明
两个氢原子分别受硝基氧原子和氧化呋咱环上氧原子的影响并与之形成氢键。
3 结论
以3 52二氯苯胺和氯乙酰氯为原料经乙酰化、硝化制得32氯24 62二硝基2N 2氯乙酰苯胺然后进一步叠氮化、热解环化、碱性条件下水解得到目标化合物72氨基262硝基苯并氧化呋咱。合成路线设计合理反应条件温和试剂易得收率高。ANBDF分子含有氨基、硝基、呋咱基和苯环所有原子几乎处于同一平面上形成大π键共轭体系分子稳定DSC分析结果表明ANBDF的分解峰温为19913 ℃ (升温速率10 ℃·min- 1 氮气氛) ANBDF是热稳定性的含能化合物。ANBDF分子结构对称、形状较规整存在分子内氢键同一层分子之间空隙较小;分子中所有原子几乎处于同一平面晶体中层与层之间较密这决定了此分子具有高密度(实测值11928 g/ cm3 ) 。ANBDF晶体密度为11931 g·cm- 3 与该分子的结构特点相对应。参考文献:
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第8期张彩宁等:虎杖提取物高效液相色谱分析方法的优化·765·
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