抗体制备的新技术
1 人鼠嵌合和转基因技术
应用DNA 重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗体基因的恒定区重组再将重组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达使可变区人源化获得人鼠嵌合抗体。通过携带部分人抗体可变区基因位点的转基因小鼠利用杂交瘤技术获得人源化抗体。其方法是将人的轻、重链基因通过脂质体导入或原生质体融合入小鼠胚胎干细胞获得含目的抗体的轻链和重链的小鼠后与内源性轻、重链双缺失的小鼠杂交可筛选到能产生目的抗体的小鼠。人鼠嵌合抗体和人源化抗体有效地克服了HAMA的缺陷占据了目前治疗性抗体的商品市场截止到2004年美国FDA批准生产的17个治疗性抗体中有12个是人鼠嵌合或人源化抗体(表1)。
2 展示技术
展示技术为获得抗体提供了强有力的工具它既保存了天然抗体谱又能通过DNA重组建立抗体库筛选出新奇的分子。可分为以细胞为基础系统的噬菌体展示技术和细胞表面展示技术以及无细胞系统的核糖体展示技术和mRNA展示技术。
2.1 噬菌体展示技术 1990年McCafferty等报道了用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体的方法此后得到了广泛的应用。噬菌体展示技术是一种基因表达产物和亲和筛选相结合的技术以改构的噬菌体为载体把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面进而通过亲和富集法筛选出有特异肽或蛋白质的噬菌体。其建立基于三个原因:①在pⅢ和pⅧ衣壳蛋白的N端插入外源基因形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面不影响和干扰噬菌体的生活周期同时保持的外源基因天然构象也能被相应的抗体或受体所识别;②利用固定与固相支持物的靶分子采用适当的淘洗(panning)方法洗去非特异结合的噬菌体筛选出目的噬菌体;③外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。噬菌体抗体库技术模拟了机体免疫系统的选择作用利用噬菌体载体构建抗体文库通过己知抗原筛选特异的高亲和性抗体。该技术实现了基因型和表现型的转换。利用噬菌体展示技术筛选出的多肽特异性高、容易保存而且可大量制备避免了常规抗体制备周期长、特异性不高、纯化复杂等缺陷。
2.2 细胞表面展示技术 细胞表面展示技术包括细菌细胞表面展示技术和酵母表面展示技术它和噬菌体展示技术都依赖细胞技术和体内基因的表达。但二者也有不同噬菌体展示是将表达的重组蛋白或多肽融合到噬菌体外壳蛋白区细胞表面展示是将表达的重组蛋白与筛选信号直接合并到细胞表面。10年前首例报道了在革兰阳性菌上的表面展示技术此后被广泛应用于免疫学、微生物学和生物工程学。Feldhaus等用流式细胞计量术从无免疫性的酿酒酵母表面展示库中分离出人单链抗体SCFV片段。Fab抗体片段亦能展示在酿酒酵母表面Blaise等用酵母杂交构建了多样化的酵母细胞表面展示库并应用于制备高亲和力的Fab抗体片段。
2.3 核糖体展示和mRNA展示技术 核糖体展示和mRNA展示技术被认为是下一代在体外生成抗体的展示技术它是一种不依赖细胞系统的离体筛选蛋白质和多肽的方法它的基本原理是将表现型的蛋白质与基因型的mRNA耦联生成稳定的蛋白质-核糖体-mRNA复合物或蛋白质-mRNA二元复合物并利用mRNA 的可复制性使靶基因(蛋白)得到有效富集的一项技术。核糖体展示和mRNA展示技术筛选抗体的整个过程都在体外进行不受细菌转化的限制能产生更大容量的库。另外由于mRNA链和其所编码的蛋白质共价连接可以在严格的选择条件下筛选突变体去除更多的对照准确地筛选出有意义的突变体。因此具有比以细胞为基础系统的噬菌体展示技术和细胞表面展示技术更多的优点。它适用于外源性中毒、蛋白水解敏感和不稳定的蛋白并允许在确定位点上合并被修饰过的氨基酸。结合PCR技术通过突变和淘汰的反复循环导致连续的DNA 多样化和蛋白质淘汰获得改良功能的抗体。通过一种或多种原核和真核细胞表达系统还可以获得衍生的抗体从而得到更大的抗体库。
