微丝的染色方法

发布时间:2013-08-08

 

实验原理

1. 微丝普遍存在于多种细胞,对细胞的形状和运动有一定作用。细胞松驰素B 可与微丝的亚单位肌动蛋白结合,从而破坏微丝,改变细胞的形状。

2. 丽藻细胞大,整个细胞的中央为大液泡占据。靠近液泡是一层溶胶样流动的内质,在内质与质膜之间,为静止的外质,其中含有叶绿体。内质中含有许多颗粒,可以清楚地看到胞质环流。在丽藻细胞中的微丝与胞质环流有密切关系。成束的微丝出现在外质与内质接口(溶胶和凝胶接口)并交织一起,与环流方向平行。用细胞松弛素B 处理后,就可抑制胞质的环流运动。

实验试剂

PBS(pH7.2)

2%Triton X—100 液

M—缓冲液

3%戊二醛固定液

0.2%考马斯亮兰染液

100μg/ml 的细胞松驰素B

DMEM 培养液

实验设备

光学显微镜一台

镊子一把

小平皿六个

载片三个

吸水纸

37℃恒温箱

实验材料

盖片培养的成纤维细胞三片

实验步骤

1. 成纤维细胞微丝的染色及其对细胞松驰素B 的反应

    (1) 在平皿中有三张成纤维细胞贴壁生长的盖片,在净工作台内将一张盖片移入另一皿中继续培养,用作对照;

    (2) 在有两片的平皿内加100μg/ml 的细胞松弛素B 4 滴继续培养半小时;

    (3) 将用细胞松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理,另一张用培养液洗五次(在平皿内换五次培养液,每次都要摇动),继续培养、观察。两小时后细胞形状恢复,接近正常;

    (4) 对恢复的盖片与张没用药的盖片一同做染色处理;

    (5) 染色处理

         ①将需染色的盖片放入盛有PBS 的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片,换液三次,每次3 分钟,洗去培养液;

         ②将盖片移入2%Triton X一100 液,置37℃恒温箱内处理20~30 分钟,以提取骨架以外的蛋白质,使骨架图像清晰;

         ③立刻将盖片移入M一缓冲液,换洗三次,每次3 分钟。M一缓冲液有稳定细胞骨架的作用;

         ④将盖片移入3%戊二醛固定15 分钟;

         ⑤将盖片移入0.2%考马斯亮兰染液中,染色15 分钟。然后小心地用自来水冲洗,空气干燥。

2. 丽藻细胞内胞质环流及其对细胞松弛素B 的反应

    (1) 剪下一小块丽藻叶片(1~2cm),置于载片上,盖上盖片;

    (2) 观察(阳光充足时效果较好);

    (3) 再取一块丽藻叶片,滴一滴细胞松弛素B,10~15 分钟后盖上盖片,观察;

    (4) 洗去药物,再观察。

 

 

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