栀子黄色素标准品藏红花素的制备
藏红花素(crocin)是1种水溶性天然色素，是西红花、栀子中共有的色素类成分。栀子黄色素的主要成分为藏红花素。影响栀子黄色素品质的主要为京尼平苷，它是1种环烯醚萜葡萄糖苷，属黄酮类化合物，为白色结晶，含有结晶水，失水后熔点升高；易溶于热水、甲醇、乙醇及稀碱液中，难溶于冷水、乙醚、 CHC1。和苯等溶剂，它的耐光性差，可被B一葡萄糖苷酶水解为京尼平，栀子黄色素以其无毒无副作用的优点已广泛用于食品添加剂。另据报道，藏红花素具有明显的降低血脂、抗氧化作用，并已有以此开发新药的尝试。
栀子黄色素的测定方法主要紫外分光光度法[1]。该方法直接用栀子黄色素在440 nm 处测量其吸光度，以其吸光度值评价栀子黄色素的品质。该方法优点是简单廉价，但误差较大，不能对栀子黄色素的含量进行定性的评价。本文以栀子果实为原料，利用大孔吸附树脂联合硅胶层析法制备了纯度达>98 的栀子黄色素标准品藏红花素，为栀子黄色素纯度的确定提供了依据，可供有关研究参考。
l 材料与方法
1．1 仪器与材料
1．1．1 仪器与试剂
紫外分光光度计，755S；高效液相色谱，Ulti— mate3000；膜组件，湖北工业大学自制；傅里叶变换红外光谱仪FTIR一8400S。
无水乙醇(分析纯)，乙酸乙酯(分析纯)，甲醇(分析纯)，三氯甲烷(分析纯)。
栀子为茜草科植物栀子的干燥果实。
1．2 实验方法
1．2．1 高色价栀子黄色素精制工艺路线栀子一粉碎一脱油一栀子粕一提取一提取液一膜分离一浓缩液一大孔吸附树脂一色价300，OD 值 d0．4的栀子黄色素
1．2．2 栀子黄色素精制操作要点
(1)粉碎、脱油。栀子果实的外壳比较坚硬，而有效成分主要在果仁里面，若不对其进行破碎，脱油和提取都不能，而影响原料的利用率。将栀子果实粉碎，用正己烷采用索氏提取法进行脱油。
(2)提取。对脱油后的栀子粕进行水提，提取条件为：提取时间3 h，提取温度40℃ ，料液比(g：mL) 1：10，提取2次，提取率为98 。
(3)膜处理。由于采用水提，提取液体系中的果胶含量较高，故用1种滤膜除去栀子黄色素提取液中的果胶、可溶性蛋白质等大分子，再用1种纳滤膜进行浓缩。
(4)大孔吸附树脂吸附。通过大孔吸附树脂对栀子黄色素吸附、解吸，实验选用SX一2树脂。 SX一2型树脂有效柱高为30 cm，量取树脂3O mL，以湿法装入吸附柱中。分别进行不同流速、不同上样体积比的单因素实验，分段收集流出液，测量栀子黄色素的吸光度，确定工艺条件。
用提取液上柱吸附达饱和好后，用不同体积分数的乙醇进行梯度洗脱。分别测定洗脱液在440 nm处(栀子黄色素的大吸收波长)和238 nm(京尼平苷的大吸收波长)处的吸光度值，确定适宜的洗脱方法。
1．2．3 藏红花素制取工艺路线色价≥300，OD值<0．4的栀子黄色素一硅胶层析一藏红花素
1．2．4 藏红花素制取操作要点
(1)硅胶层析法洗脱流动相的确定。根据藏红花素的极性，选择以下4种浓度的流动相：V(乙酸乙醋)：V(甲醇)：、，(水)：10：2：1， (乙酸乙酯)： V(甲醇)： (水)一10：3：1，V(CHCl。)：V(甲醇) ： (水)一7：3：0．5，V(CHCl。)：V(甲醇)：V (水)=8：2：0．5。
将栀子黄色素精品进行薄层层析(TLC)检测，根据Tl C薄层层析各点的大小以及各点的R 值，确定洗脱流动相。
(2)拌样、上柱、上样。取1．2．1精制的栀子黄色素0．5 g，用甲醇溶解。取200 300目的柱层析硅胶 1 g，将溶解后的溶液缓慢拌人胶中。再在40~C低温下将甲醇挥干。取100 g，200～300目的柱层析硅胶，用1．2．4中(1)所确定的流动相将硅胶溶解，装柱。将拌有栀子黄色素精品的柱层析硅胶小心加入层析柱中。
(3)洗脱。用1．2．4中(1)所确定的流动相进行洗脱除杂，并且收集洗脱溶液。
(4)分析检测。将所收集的洗脱溶液进行检测，确定所制取样品为高纯度的藏红花素。
2 结果与分析
2．1 SX-2型树脂精制栀子黄色素动态吸附 2．1．1 流速对吸附效果的影响
由表1可以看出，当流速过快时，树脂的吸附量下降，栀子黄色素提早泄漏。并且在实验中可观察到，黄色素在树脂上的分布没有呈现明显的梯度变化，即吸附过程的稳定性差；当流速过慢时，树脂的吸附量过大，吸附时间延长，生产效率低，增加了树脂再生的困难。树脂的使用寿命缩短。因此，选择1．5mL／min为吸附流速。
2．1．2 粗提液的上样体积对吸附效果的影响由图1可以看出，粗提液上样体积与树脂体积之比为10：1时，对栀子黄色素和京尼平苷吸附的选择性好。所以可以确定佳上样体积比为l0：1。
2．2 SX·2型树脂精制栀子黄色素洗脱实验采用梯度洗脱法即逐渐增加乙醇体积分数的方法进行洗脱。洗脱流速为2．5 mL／min。测定粗提液及洗脱液在440 nm 的吸光值，并用HPI C检测洗脱液中京尼平苷的含量。
由图3、图4可以看出，当用乙醇体积分数0 ～ 30％进行洗脱时，既可以基本洗尽京尼平苷，又可以使栀子黄色素不损失。再用体积分数为4O ～6O 的乙醇水溶液进行洗脱，可洗脱栀子黄色素。
综合上述实验结果，确定洗脱黄色素的佳方法为梯度洗脱法：先用体积分数为0％ ～3O 的乙醇溶液洗脱除杂，再用体积分数为4O?／6～6O 的乙醇水溶液进行洗脱并收集洗脱液，干燥浓缩即制得栀子黄色素产品。
2．3 藏红花素的制备
2．3．1 洗脱流动相的确定
将栀子黄色素精品进行薄层层析(TLC)，栀子黄色素中的主要成分为藏红花素和藏红花酸，根据 TLC薄层层析板各点的大小以及各点的Rf值，选择在TLC板上大的黄点A和较大的黄点B作为重点研究对象。在 (乙酸乙酯)： (甲醇)：V(水)一 10：2：1流动相中，A的Rf值为0．18，B的Rf值为 0．28；在 (乙酸乙酯)： (甲醇)：V(水)一10：3： 1流动相中，A的Rf值为0．04，B的R 值为0．18；在 (CHC13)： (甲醇)：V(水)一7：3：0．5流动相中，A 的R 值为0．53，B 的Rf值为0．69；在V (CHC1。)：V(甲醇)：V(水)一8：2：0．5流动相极性过大，所有点接近前沿。A、B 2点的R 值过大，进行硅胶柱层析时分离效果不好。故选择流动相为在 (乙酸乙酯)：V(甲醇)：V(水)：=：10：2：1 A；在 V(乙酸乙酯)： (甲醇)：V(水)=10：3：1 B进行梯度洗脱制取藏红花素。
2．4 藏红花素的检测
2．4．1 高效液相色谱检测
色谱柱：RPC18(4．6 m×250／~m，5 m)；流动相：V(乙腈)：V(水)一50：50；流速：0．8 mL／min；柱温：3O℃ ；检测波长：440 nm。
从图5可知，藏红花素色谱峰在440 nm处有强吸收。产物经高效液相色谱检测纯度达98％ ，杂质峰较小。
2．4．2 红外光谱检测
藏红花素有7个C—C双键，构成共轭体系。共轭体系的存在使C—O基团的吸收红移，C—O的吸收出现在1 701 cm_。。藏红花素的红外光谱中有2 个较强的吸收峰，分别为O—H 的伸缩振动(3 427 cm )和糖苷键C—O的伸缩振动(1 071 cm )。
2．4．3 质谱分析(MS)
样品用体积分数为5O％ 的甲醇溶解后做质谱分析。美国Finningan公司的LC—Q MS／MS质谱仪给出的负离子谱图显示：去掉2个糖苷键的质量碎片的分子质量为328，为藏红花素的分子质量；从图7中可以得出样品藏红花素的分子质量为977，与文献 。 报道的一致。
3 结论
栀子黄色素是水溶性天然色素，同时它对金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、淋病双球菌、卡他球菌等有抑制作用，具有抗菌、抗病毒作用，是一种集营养和着色双重功能为一体的功能食品添加剂。常用的紫外分光光度法无性的检测出栀子黄色素的含量。本文以栀子果实为原料，采用大孔吸附树脂联合硅胶层析法制备栀子黄色素的标准品藏红花素。
大孔吸附树脂精制栀子黄色素的条件：吸附条件：树脂30 mL，桅子黄色素提取液上样量为300 mL；吸附流速：1．5 mL／min；洗脱条件：提取液杂质洗脱乙醇体积分数：3O ，洗脱体积5BV；栀子黄色素洗脱乙醇体积分数：5O％ ，洗脱体积5BV；硅胶柱层析法制取藏红花素的条件：洗脱流动相浓度比：在V(乙酸乙酯)：
(甲醇)： (水)一10：2：1；在V(乙酸乙酯)： (甲醇)： (水)：10：3：1，利用两项进行梯度洗脱制取藏红花素。栀子黄色素提取液经过分离纯化，经高效液相色谱检测，得到纯度达98 的藏红花素。经红外光谱，质谱测定，确定为藏红花素的结构。
