所谓实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.
1.在荧光定量PCR技术中有一个很重要的概念—— Ct值.C代表Cyclet代表thresholdCt值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）.
图1. Ct值的确定
2. 荧光域值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍即:threshold = 10 SDcycle 6-15
3. Ct值与起始模板的关系
研究表明每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕起始拷贝数越多Ct值越小.利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线其中横坐标代表起始拷贝数的对数纵坐标代表Ct值（如图2所示）.因此只要获得未知样品的Ct值即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数.
图2. 荧光定量标准曲线
4. 荧光化学
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料〔2〕.现将其原理简述如下:
1）TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针该探针为一寡核苷酸两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团.探针完整时报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时Taq酶的5&-3&外切酶活性将探针酶切降解使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离从而荧光监测系统可接收到荧光信号即每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步.如图3所示.
图3. TaqMan 荧光探针工作原理
2）SYBR荧光染料:
在PCR反应体系中加入过量SYBR荧光染料SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后发射荧光信号而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步.
