TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(通用)
（BIOTIN标记POD法适用于细胞、组织样本）
一 TUNEL检测原理
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3‘－OH末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3&-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。
二 TUNEL试剂盒组分
| 组 份 | 20 assays | 50 assays | 100 assays | 储存条件 |
| Equilibration Buffer | 1.0 mL | 2.5 mL | 5.0 mL | -20℃ |
| Biotin-11-dUTP | 20μL | 50μL | 100μL | -20℃ |
| TdT Enzyme | 80μL | 200μL | 400μL | -20℃ |
| 50×Proteinase K | 40μL | 100μL | 200μL | -20℃ |
| Streptavidin-HRP | 10μL | 25μL | 50μL | 4℃避光 |
| DAB | 2mg | 5mg | 10 mg | -20℃ |
注意事项
1 使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。
2 因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。
3 为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
4 TdT 酶反应液好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
5 另因DAB为固体粉末，使用前加入适量PBS溶解，配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按下述方法显色使用。
6 用户自备：二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等、盖玻片、载玻片、染色缸。
三 操作流程概览
本试剂盒特点 操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，并配有Proteinase K 和DAB。
高灵敏度：可以单一检出初期的凋亡细胞。
高特异性：能特异性染色凋亡细胞。
快速操作：整体操作约需3小时。
用途广泛：可应用于组织切片、细胞样本等。
方便观察：使用光学显微镜观察实验结果。
高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性
四 检测样本的预处理
TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件（参照Page 9），如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。
1 细胞样本的准备.
操作注意事项：
1. 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
2. 固定好的样本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分钟～一晚，以改善细胞的渗透性。
3. 使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。
4. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。
5. 固定液、PBS、封闭液、通透液、染色缸需用户自备，请按上述方法配制。
2 石蜡组织切片的预处理
* 注意事项：蛋白酶K处理的使用浓度、处理时间及温度，都因组织的类型不同而有所不同，需要自已摸索优化上述条件，如有问题，请根椐本说明书Page 9的《常见问题的原因及解决方案》来调整条件。例如：如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的Proteinase K（400μg/ml）处理5分钟。（本试剂盒的50×Proteinase K浓度为1mg/ml）。
其它替代方法： 石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法，即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：
替代方法1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）
替代方法2： 将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于HCl PH2，胰蛋白酶0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）
替代方法3: 将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH 6 的塑料盒中，置于微波炉中350W（低档）处理5 min。
3 冰冻切片的预处理
4 其它难于处理的组织切片的预处理
5 阳性对照及阴性对照的准备
TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片，其后续步聚与待测样本同样进行。
A：阳性对照样本的准备
组织样本在蛋白酶K处理、PBS浸洗后，细胞样本在Triton X-100通透液处理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反应液（10U-3000U DNase I，40mM Tris-HCl PH 7.910 mM NaCl 6mM MgCl2 10mM CaCl2）（用户自备）室温—37℃处理10 —30 min，其余步骤均相同。如有问题详见Page 9.
B：阴性对照样本的准备
在Page 8标记反应制备TdT酶反应液时，不添加TdT酶，其余步骤均相同。
五 标记和显色反应：
操作注意事项：
1. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。
2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应
3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
4. TdT酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。
5. 如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。
6. 用甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M醋酸巴比妥 PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（乙醇)、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80～90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。
六 常见问题的原因及解决方案.
现象
非特异性染色
（例如：非凋亡细胞的强染色）
| 现象 | 可能原因 | 建议 |
| 非特异性染色（例如：非凋亡细胞的强染色） | Biotin-dUTP的非特异性结合 | 勿使细胞干涸 在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。 |
| TdT酶的浓度过高 | 用TdT dilution buffer* 作1：2——1：10稀释， | |
| 内源过氧化物酶未被封闭 | 封闭液室温（15-25℃）封闭10min（封闭液： 3%H2O2溶于甲醇） | |
| 光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂） | 尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂 | |
| 在固定组织时样本DNA已断裂（内源核酸酶的作用） | 确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定 | |
| 固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂 | 用含有dUTP和 dAPT的溶液封闭 | |
| 染色背景较高 | 福尔马林固定导致某些含黑色素前体的细胞染成黄色 | 尝试以甲醇固定，但可能会降低检测的敏感性。 |
| 内源过氧化物酶未被封闭 | 封闭液室温（15-25℃）封闭10min（封闭液： 3%H2O2溶于甲醇） | |
| Biotin-dUTP的非特异性结合 | 在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。 | |
| 样本被支原体污染 | 使用支原体检测试剂盒检测，如阳性则制备未被污染的新样本 | |
| 标记反应试剂（TdT酶及dUTP）的浓度过高 | 稀释50%，以降胝的标记反应的浓度 | |
| 细胞处于高度增殖期 | 在非高增殖期取样检测 | |
| DAB孵育时间过长 | 减少DAB染色时间 | |
| 标记率低、染色淡至无 | 如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失） | 用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定 或福尔马林或戊二醛固定。 |
| 过度的固定导致与蛋白过度交联 | 缩短固定时间，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定 | |
| 促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低 | l 增加通透剂促渗时间 l 增加通透剂的作用温度（15-25℃） l 优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间（如：以400ug/ml作用5min） l 0.1M的柠檬酸钠70℃作用30min。 |
| 复染信号较弱 | 选择的染料不合适 | 用溶于0.1M醋酸巴比妥的r3-5%甲基绿PH4.0，或苏木素复染 |
| 阳性对照没有信号 |
| l 冷冻切片使用3U/mlR的DNase I l 石蜡切片使用 1500U/ml的DNase I l 一般样本使用10U/ml DNase I/ l 反应缓冲液：10mM Tris-HCl PH 7.9 10 mMNaCl 5mM MnCl2 10mM CaCl2 25mM KCl237℃ 反应30 min，PBS洗去。 |
| 组织样本从载玻片脱落 | 组织样本被酶从玻片消化下来 | 降低蛋白酶K的处理时间 |
