1材料牛视网膜毛细血管周细胞来源于1日龄小牛，处死后10min以内摘取眼球。Dulbecco改良Eagle培养基干粉、Ⅲ型胶原酶粉、胰蛋白酶；胎牛血清；小牛血清；四甲基偶氮唑蓝；二甲基亚砜。HBO50型倒置相差显微镜；净工作台；MCO-150A型二氧化碳培养箱；PHS-3C型精密PH计；自动平衡离心机；低温冰箱；120目筛网；酶联免疫检测仪。
1.2方法牛视网膜毛细血管周细胞体外培养：参照Gillies等的方法并加以改进，分离培养原代的视网膜毛细血管周细胞。取新鲜牛眼，4h内在无菌条件下，从角巩膜缘后3mm处环行剖开眼球，弃眼前节，小心去除玻璃体，剥离视网膜，用PBS液清洗，用剪刀剪碎，加入2g/L胶原酶适量，37℃，消化40min，120目筛网过滤，去除杂细胞及组织碎片，加入小牛血清终止消化，离心10min，弃上清液，加入200g/LDMEM培养液吹打制成细胞悬液，接种入50cm2培养瓶中，37℃，50ml/LCO2培养箱中培养，1～2d后更换培养液，以后视细胞生长情况每3～4d更换培养液。3wk以后，当细胞达到接近融合状态时，加入2.5g/L胰蛋白酶消化至细胞形态开始变圆，然后加入培养液终止消化，弯头吸管轻柔吹打使贴壁生长的周细胞进入培养液中，离心10min，弃上清液，加入200g/LDMEM培养液吹打制成细胞悬液，调整密度为5×107/L，分瓶，放入37℃，50mL/LCO2培养箱中培养，以后视细胞生长情况每3～4d更换培养液。原代细胞初始分离和鉴定主要根据细胞形态，在相差倒置显微镜下观察原代PC的形态、生长特性以及与血管碎片之间的关系。用ACTIN和Ⅷ因子抗体免疫组织化学染色进行鉴定，Ⅷ因子抗体免疫组织化学染色显示周细胞胞浆内特异性蓝紫色着色为阳性表达。分别取原代培养9d近融合的PC，消化后制成密度为3×107/L的单细胞悬液，将其接种于96孔板中，每孔接种100μL，每3d换液1次。分别于接种后1，2，4，6，8，10，12d，加入5g/LMTT溶液20μL后37℃下培养4h，然后弃除孔内上清夜，每孔加入2g/L二甲基亚砜150μL振荡5min，在酶联免疫检测仪上以590nm波长测定各孔吸光度A值。以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线。
