酶联免疫法(ELISA)测定氯霉素CAP残留

(1)试剂和材料 以下所有试剂除特别注明外，均为分析纯试剂；水为符合GB／T:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

6682规定的二级水。

①0．2mol／L硫酸

②卜葡糖苷酸酶

③乙酸乙酯

④异辛烷

⑤三氯甲烷

⑥乙酸钠

⑦氯霉素检测试剂盒(2—8~C冰箱中保存)

(2)仪器和设备

①酶联免疫反应读数仪

②分析天平 精度0．:namespace prefix = st1 ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags" />00001g

③天平 精度0．01g

④冷冻离心机

⑤50ml具塞离心管

⑥匀浆机

⑦微型振荡器

⑧回旋振荡器

⑨微量移液器

⑩恒温干燥箱

(3)测定步骤

①尿样的制备 取上层用稀释剂／洗涤缓冲剂稀释5倍，备片

②肌肉组织(包括鱼和虾)中氯霉素的提取 取38组织，加入6mi的乙酸乙酯，匀浆lmin，在2000r／mln下，离心15min。取上层4mi，在70~C下蒸干。加入2mi的异辛烷：三氯甲烷(2：3)溶解剩余物，旋转lmin。加Rmi稀释剂／洗涤缓冲剂，再旋转2rain。（如果有乳化现象，把试管放在80~C的恒温室约20min，直至见到分离层)。再在2000r／min下离心10rain，取上层备用。

③肝／肾中氯霉素的提取 取3s组织，加入3ml乙酸钠缓冲剂(o．1mol几，pH 5)和8000U 9—葡糖苷酸酶，匀浆30s，置于37~C的恒温箱内2h。加12ml的乙酸乙酯，匀浆lmin，在2000r／Illin下，离心15min。取上层lml，在70~C下蒸干。加入2ml的异辛烷：三氯甲烷(2：3)溶解剩余物，旋转lmin。加lml稀释剂／洗涤缓冲剂，再旋转2min(如果有乳化现象，把试管放在80~C的恒温室约20min，直至见到分离层)。再在2000r／mln下离心10rain，取上层备用。

④测定。

室温应控制在19—25~C。

取在19～25 0C放置1—2h的试剂盒，按每个标准溶液和试样溶液至少两孔计算所需酶联板条的数量，插入框架。每个微孔加入标准溶液或试样溶液各25tzL，再在每个微孔内加入酶标二抗100t~L，封口膜封板，室温下孵育1h。

倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体。加入250／uL稀释的稀释剂／洗涤缓冲剂到酶联板的微孔内，稍后倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，如此重复操作洗板6次。

用多道移液器加入底物125tzI。到每个微IL内，室温避光孵育20min。

用多道移液器每孔加终止液o．2mol／L硫酸100ul。

在10min内将酶联板放于酶标仪内，于450nm波长处测定吸光度值。

(4)计算 用数据分析软件对结果进行分析，绘出标准曲线，并得出试料中氯霉素的含量。

(5)灵敏度和回收率 本方法的检测限为：尿样0，25P8／L，肌肉0．1P8／k8

1．5ug／kg。

本方法在lug／kg添加浓度水平上，回收率范围为60％～120％。